一种抗CA199纳米抗体、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种抗CA199纳米抗体、制备方法及应用，涉及纳米抗体技术领域。本发明专利技术提供的抗CA199纳米抗体的制备方法，利用免疫的羊驼外周血建立噬菌体展示文库，进行初次筛选，获得优选纳米抗体；再对优选纳米抗体的VHH区域进行改造优化，使抗体亲和力成熟，再经过二次筛选获得最佳的抗CA199纳米抗体。本发明专利技术的制备方法能够得到对CA199抗原具有特异的识别和结合能力，最终筛选得到的纳米抗体亲和力可达到2.08E

【技术实现步骤摘要】
一种抗CA199纳米抗体、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及纳米抗体
，尤其涉及一种抗CA199纳米抗体、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，由于早期缺乏典型的临床表现，临床上90％以上的患者确诊时已经属于中晚期，失去最佳治疗时机。因此寻找合适的胰腺癌标志物，并开发高灵敏度的检测方法是目前的研究重点。糖类抗原CA199是细胞膜上的一种糖脂质，分子量为1000KD，胰腺癌血清中CA199的水平是正常均值的683倍，是目前胰腺癌的有效标志物，临床检测中通常通过检测CA199水平确定血清样本是否来源于胰腺癌患者，其诊断的敏感性可达70％
‑
95％，特异性为72％
‑
90％。此外，CA199在结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也很高。为了实现胰腺癌高灵敏度的检测，必须筛选高亲和力的抗体。
[0003]目前CA199的抗体主要是单克隆鼠抗，以国外进口较多，价格昂贵。此外，传统的抗体还存在一些缺点，如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合和中和效果。
[0004]纳米抗体是在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，纳米抗体兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。
[0005]然而，目前尚未有关于抗CA199纳米抗体的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是开发一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，具有高度特异的抗原识别能力、高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在CA199抗原的免疫检测中获得优异的检测效率。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种抗CA199纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、用CA199抗原对成年羊驼进行免疫，采集免疫成功的羊驼外周血，构建一代纳米抗体噬菌体展示文库，进行CA199纳米抗体的初次筛选，获得优选纳米抗体；
[0010]S2、对优选纳米抗体进行重组表达和纯化；
[0011]S3、对S2纯化得到的纳米抗体的CDR区域进行随机突变，构建二代纳米抗体噬菌体展示文库，进行CA199纳米抗体的二次筛选，得到抗CA199纳米抗体。
[0012]进一步地，所述步骤S1中，用CA199抗原对成年羊驼进行免疫，具体操作如下：取2mg CA199抗原溶于HEPES缓冲液，与弗氏佐剂等体积混合乳化，按照6
‑
7ug/kg的量，对成年
羊驼进行背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫5次，免疫间隔为2周。
[0013]进一步地，所述步骤S1中，还包括，从羊驼外周血分离出PBMC并提取RNA，经过反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增，将第二轮PCR产物与展示载体连接，构建一代纳米抗体噬菌体展示文库；
[0014]其中，两轮PCR扩增所用引物分别为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4。
[0015]进一步地，所述步骤S1中，进行CA199纳米抗体的初次筛选具体操作如下：
[0016]以CA199抗原包被免疫管，用2
‑
5％BSA封闭，PBST洗涤；加入100uL第一纳米抗体噬菌体，室温孵育1
‑
3h，用PBST洗涤8
‑
12次，用胰蛋白酶洗脱结合CA199的噬菌体；洗脱的噬菌体经过转染SS320后进入下一轮筛选；经过2
‑
4轮筛选后，利用ELISA验证阳性克隆子，获得优选纳米抗体，并测序。
[0017]进一步地，所述步骤S3中，对S2纯化得到的纳米抗体的CDR区域进行随机突变，具体包括：使用多段的简并引物对CDR区域进行多轮的PCR扩增，得到的最后一轮PCR扩增产物为突变后的DNA文库；
[0018]其中，第一轮扩增所用引物分别为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8；第二轮扩增所用引物分别为SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.6。
[0019]进一步地，所述步骤S3中，还包括将最后一轮PCR产物与展示载体连接，构建二代纳米抗体噬菌体展示文库。
[0020]进一步地，所述步骤S3中，进行CA199纳米抗体的二次筛选，具体包括：
[0021]将PBS重悬后的二代纳米抗体噬菌体加入2
‑
5％的milk，封闭1h；同时封闭空管及磁珠2h；
[0022]二代纳米抗体噬菌体封闭1h后加入CA199抗原，继续封闭1h；之后，加入封闭好的磁珠，继续封闭半小时；
[0023]随后洗脱未结合的二代纳米抗体噬菌体，更换封闭好的离心管，去除上清，洗脱去除磁珠；
[0024]将洗脱磁珠的二代纳米抗体噬菌体经过感染TG1进入下一轮筛选，筛选2
‑
5轮，每轮筛选后随机挑单克隆进行测序，分析序列富集程度，选取序列进行表达。
[0025]进一步地，所述步骤S3中，还包括，将表达纯化得到的纳米抗体进行活性检测和亲和力检测，将检测结果按优到次排序，选取检测结果为优的纳米抗体作为最佳的抗CA199纳米抗体。
[0026]进一步地，所述步骤S2中，还包括，对纯化得到的纳米抗体进行活性检测和亲和力检测。
[0027]第二方面，本专利技术提供一种抗CA199纳米抗体，由第一方面所述的制备方法制得。
[0028]最后，本专利技术还提供所述的抗CA199纳米抗体在制备免疫法检测CA199试剂盒中的应用。
[0029]进一步地，所述免疫法为双抗夹心免疫法。
[0030]与现有技术相比，本专利技术所能达到的技术效果包括：
[0031]本专利技术提供的抗CA199纳米抗体的制备方法，利用免疫的羊驼外周血建立噬菌体展示文库，进行CA199纳米抗体的初次筛选，获得优选纳米抗体；再对优选纳米抗体的VHH区
域进行改造优化，使抗体亲和力成熟，再经过二次筛选获得最佳的抗CA199纳米抗体。能够制备得到对CA199抗原具有特异的识别和结合能力，最终筛选得到的纳米抗体亲和力可达到2.08E
‑
11，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本专利技术提供的纳米抗体制备方法能够充分发挥纳米抗体的优越性能，开发周期短。
[0032]根据本专利技术筛选得到的最佳的抗CA199纳米抗体，制备成试剂盒，进行性能验证，显示该试剂盒具有灵敏度高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CA199纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用CA199抗原对成年羊驼进行免疫，采集免疫成功的羊驼外周血，构建一代纳米抗体噬菌体展示文库，进行CA199纳米抗体的初次筛选，获得优选纳米抗体；S2、对优选纳米抗体进行重组表达和纯化；S3、对S2纯化得到的纳米抗体的CDR区域进行随机突变，构建二代纳米抗体噬菌体展示文库，进行CA199纳米抗体的二次筛选，得到抗CA199纳米抗体。2.如权利要求1所述的抗CA199纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，还包括，从羊驼外周血分离出PBMC并提取RNA，经过反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增，将第二轮PCR产物与展示载体连接，构建一代纳米抗体噬菌体展示文库；其中，两轮PCR扩增所用引物分别为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4。3.如权利要求1所述的抗CA199纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，进行CA199纳米抗体的初次筛选具体操作如下：以CA199抗原包被免疫管，用2
‑
5％BSA封闭，PBST洗涤；加入100uL第一纳米抗体噬菌体，室温孵育1
‑
3h，用PBST洗涤8
‑
12次，用胰蛋白酶洗脱结合CA199的噬菌体；洗脱的噬菌体经过转染SS320后进入下一轮筛选；经过2
‑
4轮筛选后，利用ELISA验证阳性克隆子，获得优选纳米抗体，并测序。4.如权利要求1所述的抗CA199纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，对S2纯化得到的纳米抗体的CDR区域进行随机突变，具体包括：使用多段的简并引物对CDR区域进行多轮的PCR扩增，得到的最后一轮PCR扩增产...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泓彦，胡利华，李梦凡，范海艳，赖燕晖，谢宝，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：