CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，尤其是涉及CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用。本发明专利技术的CDH17特异性分子影像探针实现了对人CDH17分子表达的无创可视化，进一步实现了结直肠癌的无创诊断；所述探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点；通过筛选CDH17高表达的患者，进一步开展CDH17特异性放射免疫治疗，从而实现CDH17表达阳性肿瘤的靶点特异性诊疗一体化。的靶点特异性诊疗一体化。的靶点特异性诊疗一体化。

【技术实现步骤摘要】
CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体
，尤其是涉及CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]1993年比利时科学家Hamers等人在《Nature》杂志中首次报道在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体(Nature.1993；363(6428):446
‑
8.)，这种具有特殊结构域的抗体即为重链抗体(Heavy
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chain antibodies,HCAbs)。通过分子生物学手段，克隆重链抗体的可变区即可得到只有重链可变区的抗原结合片段，即为纳米抗体(VHH，Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)。VHH晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称为纳米抗体(Ablynx公司注册商品名)。纳米抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小抗体单位，具有亲和力高、分子量小、制备成本低廉(既可以运用大肠杆菌表达，也可以运用酵母、中国仓鼠卵巢细胞等真核表达体系表达)、易于临床转化和推广应用的优点。
[0003]纳米抗体是近年来构筑分子影像探针的热门靶向载体(Theranostics.2014；4(4):386
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98；J Nucl Med.2022Oct；63(10):1705
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1709)。目前，多种短半衰期核素已用于标记纳米抗体，制备纳米抗体分子影像探针。锝
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99m(
99m
Tc；T
1/2
＝6.02h)标记靶向程序性死亡配体1(PD
‑
L1)的纳米抗体探针已成功转化至临床，用于非小细胞肺癌患者的无创诊断(J Nucl Med.2019；60(9):1213
‑
1220.)；镓
‑
68(
68
Ga；T
1/2
＝1.1h)标记靶向人类表皮生长因子受体(HER2)的纳米抗体探针也已成功转化至临床，用于乳腺癌的无创诊断(J Nucl Med.2016；57(1):27
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33.)。以上实例说明放射性核素标记纳米抗体探针极具临床转化应用前景，可用于人类恶性肿瘤的早期无创诊断、关键致病靶点的可视化、单克隆抗体(mAb)治疗患者的筛选以及单克隆抗体治疗后疗效评价。
[0004]肝肠钙粘蛋白CDH17为钙依赖膜相关蛋白，是钙粘蛋白超家族的一员。CDH17具有七个细胞外结构域、一个跨膜区及一个短细胞质结构域，该短细胞质结构域与经典钙粘蛋白高度保守的细胞质结构域无同源性。与经典钙粘蛋白不同，CDH17并不诱导β连环蛋白表达上调和肌动蛋白细胞骨架重组，其粘附特性主要由细胞外结构域决定。正常情况下，CDH17主要表达于成人小肠及结肠肠上皮中，在器官发育和维持组织完整性及肠肽转运上有重要作用。近年来研究发现，CDH17异常表达与许多消化道肿瘤的高发生率显著相关。在肝癌中，约80％的患者CDH17表达升高，且分布于细胞膜和细胞质中。除了表达量的增加，肝癌细胞中还存在异常剪接体，比如外显子7缺失的CDH17。在正常胃上皮细胞中CDH17不表达，而在胃癌尤其是肠型胃癌中CDH17过表达，与不良病理特征如组织学分期、肿瘤浸润和淋巴结转移等密切相关，是预测肿瘤进展和预后的重要指标。对于原发性结直肠癌，有研究表明CDH17表达下调能够抑制结肠癌细胞的侵袭与转移，且通过组织芯片分析发现，CDH17在结直肠腺癌中过表达，为诊断结直肠腺癌的免疫组织化学标记物且敏感度优于CDX2。在治疗上，当CDH17受抑制时，β连环蛋白和磷酸化糖原合成激酶3β(GSK
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3β)合成减少及定位
ID No.7所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的CDR3。
[0011]更具体地，本专利技术的CDH17特异性纳米抗体具有SEQ ID No.4或9所示的氨基酸序列。
[0012]在本专利技术中，为了简便起见，将具有SEQ ID No.4或9所示的氨基酸序列的CDH17特异性纳米抗体分别称为CDH1或CDH2。
[0013]如本文所用，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1
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CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single
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domain antibody,sdAb)或VHH(Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)，它们可互换使用。
[0014]在一些实施方案中，本专利技术还涵盖如本文所述的CDH17特异性纳米抗体的抗原结合片段。
[0015]如本文中所使用的，术语“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文以用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本专利技术纳米抗体的酶促或化学断裂产生本专利技术抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
[0016]可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本专利技术提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。
[0017]在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
[0018]如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences of Pro本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CDH17特异性纳米抗体，其特征在于，包含：(1)具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的CDR3，或(2)具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的CDR3，优选地，所述CDH17特异性纳米抗体具有SEQ ID No.4或9所示的氨基酸序列。2.一种CDH17特异性纳米抗体融合蛋白，其特征在于，包含根据权利要求1所述的纳米抗体和白蛋白结合域，优选地，所述白蛋白结合域具有SEQ ID No.11或12所示的氨基酸序列，优选地，所述CDH17特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.13或15所示的氨基酸序列。3.一种多核苷酸，其特征在于，编码根据权利要求1所述的CDH17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的CDH17特异性纳米抗体融合蛋白，优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID No.5、10、14或16所示的核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于，包含根据权利要求3所述的多核苷酸。5.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求4所述的载体。6.一种CDH17特异性分子影像探针，其特征在于，包含经放射性核素标记的根据权利要求1所述的CDH17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的CDH17特异性纳米抗体融合蛋白。7.根据权利要求6所述的分子影像探针，其特征在于，根据权利要求1所述的CDH17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的CDH17特异性纳米抗体融合蛋白经由双功能螯合剂被放射性核素标记，优选地，所述双功能螯合剂选自p
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SCN
‑
Bn
‑
NOTA，优选地，所述放射性核素选自Tc
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99m、Ga
‑
68、F
‑
18、I
‑
123、I
‑
125、I
‑
131、I
‑
124、In
‑
111、Ga
‑
67、Cu
‑
64、Zr
‑
89、C
‑
11、Lu
‑
177、Re
‑
188、Y
‑
86、Mn
‑
52、Sc
‑
44、Lu
‑
177、Y
‑
90、Ac
‑
225、At
‑
211、Bi
‑
212、Bi
‑
213、Cs
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137、Cr
‑
51、Co
‑
60、Dy
‑
165、Er
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169、Fm
‑
255、Au
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198、Ho
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166、I
‑
125、I
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131、Ir
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192、Fe
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59、Pb
‑
212、Mo
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99、Pd
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103、P
‑
32、K
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42、Re
‑
186、Re
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188、Sm
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153、Ra
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223、Ru
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106、Na
‑
24、Sr
‑
89、Tb
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149、Th
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227、Xe
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133、Yb
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏伟军，潘心冰，刘建军，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：