【技术实现步骤摘要】
本申请涉及微生物工程领域，更具体地说，它涉及一种细菌表面拓扑糖基化的方法。
技术介绍
1、细菌细胞表面装饰着各种寡糖和多糖，包括荚膜多糖、脂多糖、糖蛋白和细胞壁相关糖缀合物，它们主要决定细菌与宿主之间的相互作用，并在特定生态位中对细菌的生存起着至关重要的作用。因此，精确地控制糖分子在细菌表面的丰度和分布，并系统地研究其对细菌行为的影响，是微生物工程领域的一个重要课题。
2、基因工程已被广泛用于调节细菌胞外多糖的合成和分泌，赋予细菌新的功能并改变与宿主的相互作用模式。这种工程方法在保护微生物细胞免受各种环境胁迫和提高微生物疗法的治疗效果方面是有效的。尽管基因工程的使用在细菌表面糖基化方面取得了令人瞩目的进展，但由于基因回路的复杂设计和特定转录-翻译系统的参与，可用于这种修饰的细菌菌株和糖的类型受到限制。此外，通过基因工程精确控制细菌表面糖组分的丰度和相对分布仍然具有挑战性。
技术实现思路
1、为了精确地控制糖分子在细菌表面的丰度和分布，增加益生菌在相应部位的粘附和定植，提高益生菌作为活体药物的生物利用度，本申请提供一种细菌表面拓扑糖基化的方法，具体采用以下技术方案：
2、一种细菌表面拓扑糖基化的方法，包括以下步骤：
3、以炔丙胺、丙烯酸甲酯和乙二胺为原料，通过迭代michael加成反应和酰胺缩合反应，合成具有不同糖末端数目的炔基化拓扑结构；
4、将细菌通过酰胺缩合反应进行叠氮基团功能化，利用铜催化叠氮化物-炔环加成反应，得到拓扑糖基化益
5、优选的，所述以炔丙胺、丙烯酸甲酯和乙二胺为原料，通过迭代michael加成反应和酰胺缩合反应，合成具有不同糖末端数目的炔基化拓扑结构指的是以下步骤：
6、①中间体a的合成：将炔丙胺溶解于甲醇中，随后将其滴加到含甲醇的丙烯酸甲酯搅拌溶液中，冰浴；将所得混合物在0℃下连续搅拌后，返回室温继续搅拌，经过旋转蒸发、硅胶柱层析纯化、真空干燥等一系列工艺，最终得到中间体a；
7、②拓扑化合物b的合成：将溶解于甲醇的中间体a滴入含甲醇的乙二胺溶液中，在0℃下反应，反应完毕后，室温搅拌，随后旋转蒸发除去溶剂；用甲苯和甲醇的共沸混合物洗去残留的乙二胺；经真空蒸馏后，用闪柱色谱法纯化，最终得到拓扑化合物b；
8、③中间体c的合成：将拓扑化合物b的甲醇溶液滴入丙烯酸甲酯与甲醇的混合物中，在0℃下静置，随后搅拌，逐渐加热至室温，继续搅拌；旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物经生理盐水洗涤，闪柱层析纯化，最终得到中间体c；
9、④拓扑化合物d的合成:将中间产物c溶解于dmf中，然后将该溶液滴加到dmf的乙二胺溶液中搅拌，得到的反应混合物在60℃下连续搅拌，旋转蒸发除去溶剂和未反应的乙二胺，然后用乙醚洗涤，过滤得到粗产物，通过闪蒸柱层析纯化，得到拓扑化合物d；
10、⑤topoi的合成:炔丙胺与d-葡萄糖内酯进行酰胺缩合反应，得到topoi；
11、⑥topoii的合成：拓扑化合物b与d-葡萄糖酸内酯进行酰胺缩合反应，得到topoii；
12、⑦topoiv的合成:拓扑化合物d与d-葡萄糖酸内酯进行酰胺缩合反应，得到topoiv。
13、优选的，步骤①的具体步骤为：将18mmol炔丙胺溶解于40ml甲醇中，随后将其滴加到含10ml甲醇的45mmol丙烯酸甲酯溶液中搅拌，冰浴1小时，将所得混合物在0℃下连续搅拌1h，然后返回室温继续搅拌48h，经过旋转蒸发、硅胶柱层析纯化、真空干燥等一系列工艺，最终得到中间体a。
14、优选的，步骤②的具体步骤为：将8.5mmol中间体a溶解于10ml甲醇中，得到中间体a的甲醇溶液，将410mmol乙二胺溶解于80ml甲醇中，得到乙二胺的甲醇溶液，将中间体a的甲醇溶液滴入乙二胺的甲醇溶液中，在0℃下反应1h；返回室温后，再搅拌48小时，然后在35℃下旋转蒸发除去溶剂；用体积比为9:1的甲苯和甲醇的共沸混合物洗去残留的乙二胺；经真空蒸馏后，用闪柱色谱法纯化，最终得到拓扑化合物b。
15、优选的，步骤③的具体步骤为：将3.5mmol拓扑化合物b溶解于4ml甲醇中，得到拓扑化合物b的甲醇溶液，将21mmol丙烯酸甲酯溶解于14ml甲醇中，得到丙烯酸甲酯的甲醇溶液，将拓扑化合物b的甲醇溶液滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，在0℃下静置1h，搅拌1h，逐渐加热至25℃，再搅拌96h，旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物经生理盐水洗涤，闪柱层析纯化，得到中间产物c。
16、优选的，步骤④的具体步骤为：将1.6mmol中间产物c溶解于10ml dmf中，得到中间产物c的dmf溶液，然后滴入含有8ml乙二胺的dmf溶液中，在60℃下连续搅拌48h，通过旋转蒸发除去溶剂和未反应的乙二胺，然后用150-200ml乙醚洗涤，过滤得到粗产物，闪蒸柱层析纯化，得到拓扑化合物d。
17、优选的，步骤⑤的具体步骤为：将6mmol炔丙胺溶解在含有200μl三乙胺的dmf溶液中，然后加入12mmold-葡萄糖酸内酯，在30℃下连续搅拌过夜，用旋转蒸发法除去溶剂后，所得沉淀物用乙醚洗涤两次，粗产物通过闪蒸柱层析进一步纯化，并在真空下干燥过夜，得到topoi。
18、优选的，步骤⑥的具体步骤为：将4mmol拓扑化合物b溶于15ml无水dmf中冰浴5min，然后加入12mmol d-葡萄糖酸内酯和600μl三乙胺，在40℃下搅拌16h，得到的粗产物在真空下浓缩，硅胶柱层析纯化，然后溶于水冻干，得到topoii。
19、优选的，步骤⑦的具体步骤为：将2mmol拓扑化合物d在室温下溶解于40ml无水dmf中，然后加入14mmol d-葡萄糖内酯和2ml三乙胺，将反应混合物在40℃下滴加800μl dipea连续搅拌24h，真空旋转蒸发去除溶剂后，沉淀用乙醚和冷水交替洗涤3次，过滤后再溶解在体积比为10:1的去离子水和dmso的混合溶剂中进行冻干，然后用制备薄层色谱法和闪蒸柱色谱法纯化冻干后的粗产物，最终产品被收集，蒸发，并在真空下干燥，得到topoiv。
20、优选的，所述将细菌通过酰胺缩合反应进行叠氮基团功能化，利用铜催化叠氮化物-炔环加成反应，得到拓扑糖基化益生菌指的是以下步骤：
21、将携带pbbr1mcs2-tac-mcherry的益生菌在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中37℃培养过夜，收集细菌，在4500rpm下离心5min，重悬于1×pbs溶液中，od600nm，约1.0；取1ml ecn(1×108cfus/ml)与nhs-peg2000-n3在37℃共孵育1h,pbs洗涤和离心收集获得叠氮功能化益生菌；
22、将叠氮功能化益生菌分别悬浮在含有topoi、topoii和topoiv的cubr溶液中，反应得到tgp-i、tgp-ii和tgp-iv。
23、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
24、通过该方法得到的拓扑糖基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，所述以炔丙胺、丙烯酸甲酯和乙二胺为原料，通过迭代Michael加成反应和酰胺缩合反应，合成具有不同糖末端数目的炔基化拓扑结构指的是以下步骤：
3.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤①的具体步骤为：将18mmol炔丙胺溶解于40mL甲醇中，随后将其滴加到含10mL甲醇的45mmol丙烯酸甲酯溶液中搅拌，冰浴1小时，将所得混合物在0℃下连续搅拌1h，然后返回室温继续搅拌48h，经过旋转蒸发、硅胶柱层析纯化、真空干燥等一系列工艺，最终得到中间体A。
4.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤②的具体步骤为：将8.5mmol中间体A溶解于10mL甲醇中，得到中间体A的甲醇溶液，将410mmol乙二胺溶解于80mL甲醇中，得到乙二胺的甲醇溶液，将中间体A的甲醇溶液滴入乙二胺的甲醇溶液中，在0℃下反应1h；返回室温后，再搅拌48小时，然后在35℃下旋转蒸发除去溶剂；用体积比为9:1的
5.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤③的具体步骤为：将3.5mmol拓扑化合物B溶解于4mL甲醇中，得到拓扑化合物B的甲醇溶液，将21mmol丙烯酸甲酯溶解于14mL甲醇中，得到丙烯酸甲酯的甲醇溶液，将拓扑化合物B的甲醇溶液滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，在0℃下静置1h，搅拌1h，逐渐加热至25℃，再搅拌96h，旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物经生理盐水洗涤，闪柱层析纯化，得到中间产物C。
6.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤④的具体步骤为：将1.6mmol中间产物C溶解于10ml DMF中，得到中间产物C的DMF溶液，然后滴入含有8mL乙二胺的DMF溶液中，在60℃下连续搅拌48h，通过旋转蒸发除去溶剂和未反应的乙二胺，然后用150-200mL乙醚洗涤，过滤得到粗产物，闪蒸柱层析纯化，得到拓扑化合物D。
7.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤⑤的具体步骤为：将6mmol炔丙胺溶解在含有200μL三乙胺的DMF溶液中，然后加入12mmold-葡萄糖酸内酯，在30℃下连续搅拌过夜，用旋转蒸发法除去溶剂后，所得沉淀物用乙醚洗涤两次，粗产物通过闪蒸柱层析进一步纯化，并在真空下干燥过夜，得到TopoI。
8.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤⑥的具体步骤为：将4mmol拓扑化合物B溶于15mL无水DMF中冰浴5min，然后加入12mmol d-葡萄糖酸内酯和600μL三乙胺，在40℃下搅拌16h，得到的粗产物在真空下浓缩，硅胶柱层析纯化，然后溶于水冻干，得到TopoII。
9.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤⑦的具体步骤为：将2mmol拓扑化合物D在室温下溶解于40mL无水DMF中，然后加入14mmol d-葡萄糖内酯和2mL三乙胺，将反应混合物在40℃下滴加800μL DIPEA连续搅拌24h，真空旋转蒸发去除溶剂后，沉淀用乙醚和冷水交替洗涤3次，过滤后再溶解在体积比为10:1的去离子水和DMSO的混合溶剂中进行冻干，然后用制备薄层色谱法和闪蒸柱色谱法纯化冻干后的粗产物，最终产品被收集，蒸发，并在真空下干燥，得到TopoIV。
10.根据权利要求1所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，所述将细菌通过酰胺缩合反应进行叠氮基团功能化，利用铜催化叠氮化物-炔环加成反应，得到拓扑糖基化益生菌指的是以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，所述以炔丙胺、丙烯酸甲酯和乙二胺为原料，通过迭代michael加成反应和酰胺缩合反应，合成具有不同糖末端数目的炔基化拓扑结构指的是以下步骤：
3.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤①的具体步骤为：将18mmol炔丙胺溶解于40ml甲醇中，随后将其滴加到含10ml甲醇的45mmol丙烯酸甲酯溶液中搅拌，冰浴1小时，将所得混合物在0℃下连续搅拌1h，然后返回室温继续搅拌48h，经过旋转蒸发、硅胶柱层析纯化、真空干燥等一系列工艺，最终得到中间体a。
4.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤②的具体步骤为：将8.5mmol中间体a溶解于10ml甲醇中，得到中间体a的甲醇溶液，将410mmol乙二胺溶解于80ml甲醇中，得到乙二胺的甲醇溶液，将中间体a的甲醇溶液滴入乙二胺的甲醇溶液中，在0℃下反应1h；返回室温后，再搅拌48小时，然后在35℃下旋转蒸发除去溶剂；用体积比为9:1的甲苯和甲醇的共沸混合物洗去残留的乙二胺；经真空蒸馏后，用闪柱色谱法纯化，最终得到拓扑化合物b。
5.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤③的具体步骤为：将3.5mmol拓扑化合物b溶解于4ml甲醇中，得到拓扑化合物b的甲醇溶液，将21mmol丙烯酸甲酯溶解于14ml甲醇中，得到丙烯酸甲酯的甲醇溶液，将拓扑化合物b的甲醇溶液滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，在0℃下静置1h，搅拌1h，逐渐加热至25℃，再搅拌96h，旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物经生理盐水洗涤，闪柱层析纯化，得到中间产物c。
6.根据权利要求2所述的细菌表面拓扑糖基化的方法，其特征在于，步骤④的具体步骤为：将1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘尽尧，匡晓，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：
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