靶向HSP70的纳米抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术生物技术领域，尤其涉及一种靶向HSP70的纳米抗体及其制备方法与应用。公开了一种靶向HSP70的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb D8，其中，所述纳米抗体Nb D8的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。由于提供的纳米抗体Nb D8能够与HSP70高度结合，与HSP70具有较高的亲和力和特异性，因此，通过纳米抗体Nb D8可靶向作用于HSP70，为后续的PROTAC复合物构建提供夯实的理论基础，同时这一全新概念的提出为临床提供了全新的治疗策略。提出为临床提供了全新的治疗策略。提出为临床提供了全新的治疗策略。

【技术实现步骤摘要】
靶向HSP70的纳米抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种靶向HSP70的纳米抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]HSP70是一种热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)，又称为应激蛋白(Stress protein.SP)，它们是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于原核、真核细胞中。
[0003]HSP70在正常细胞中的表达量不高，但是在维护细胞内环境稳态及正常生命活动有着至关重要的作用。但是随着研究的进展，人们发现HSP70表达量的增加往往伴随着肿瘤的发生发展，在多种肿瘤细胞上已经发现HSP70存在高表达的现象。肿瘤细胞是一组增殖异常，脱离正常生理调控的细胞群，为了适应过度生长所产生的的种种压力，肿瘤细胞便需要一种“伴侣分子”协助它们渡过难关，HSP70则是这一强力“辅助伴侣”以充当一个应对细胞应激的强力缓冲系统，帮助其适应微环境下的种种压力(氧化应激水平升高、营养缺乏、缺氧、突变蛋白水平增加等)。
[0004]目前已有大量体内外研究报道，HSP70的高表达显著刺激不同类型瘤细胞的增殖与细胞迁移。在结直肠癌中，HSP70稳定参与受体酪氨酸激酶(RTK)和WNT信号通路的蛋白质来调节肠上皮细胞中的有丝分裂信号传导诱导肿瘤发生；在肝癌中，HSP70的敲除显著下调了肿瘤细胞的增殖及迁移，细胞周期明显受到阻滞，周期蛋白表达下调；在胃癌中，反寡义核苷酸处理后的HSP70表达下调同时伴随着肿瘤细胞的凋亡及周期阻滞。除了促进增殖外，HSP70同样可以增强肿瘤细胞的抗免疫细胞以耐药能力，极大增加了肿瘤细胞的免疫逃逸及耐药现象。HSP70与肿瘤的发展如此密切，目前已有科学家将其视为肿瘤预后及诊断标志物，例如，HSP70在肝细胞癌，前列腺癌，食管腺癌，淋巴结转移结直肠癌，肺癌，卵巢癌中就可以作为一个可靠的潜在很短标志物。另外，HSP70与临床肿瘤分级、生存期也密切相关，在黑色素瘤、口腔癌及膀胱癌中，HSP70均可作为一个可靠的指标为临床诊疗做出较为中肯的提示。
[0005]综上所述，HSP70的表达水平与肿瘤发生发展有着密不可分的关系，抑制HSP70的功能似乎已经成为一种有效癌症治疗手段。目前针对HSP70开发的药物主要是靶向它的两个主要结构域(NBD、SBD)，进而抑制HSP70发挥其正常生理功能。VER
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155008是一种核苷类的HSP70抑制剂，它可以与HSP70的核苷酸结合位点及NBD结构域结合，分别抑制其ATP酶活性和整体框架变构，阻止其发挥正常的生理功能；2
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苯基乙炔磺酰胺(PES)同样是一种高选择性HSP70抑制剂，通过结合HSP70的SBD结构域，竞争性抑制其与其它伴侣分子及底物蛋白的结合，扰乱细胞内蛋白平衡稳态，除此之外，各种靶向HSP70的化疗药物层出不穷，为HSP70高表达肿瘤患者提供多种治疗选择。但是上述药物仅通过抑制某一结构域容易产生脱靶现象，另外耐药的发生同样是个不容小觑的问题，为了从根源上消除HSP70而不是仅仅抑制其某一方面的功能，因此，亟需依据HSP70的特性研发相应的纳米抗体，为后续临床治疗提供全新的治疗策略。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种靶向HSP70的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏靶向HSP70的纳米抗体，以至于无法更好地利用HSP70靶点进行相关药物制备的问题。
[0007]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本申请提供了一种靶向HSP70的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb D8，其中，所述纳米抗体Nb D8的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
[0009]进一步，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
[0010]所述纳米抗体Nb D8中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]进一步，所述纳米抗体NbD8的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。
[0012]第二方面，本申请提供一种靶向HSP70的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0013]设计并合成HSP70
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NBD基因并及进行表达纯化，得到HSP70
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NBD蛋白；
[0014]将所述HSP70
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NBD蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；
[0015]将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；
[0016]将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向HSP70的纳米抗体。
[0017]进一步，所述富集筛选的步骤中，进行2～3轮富集筛选。
[0018]进一步，将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒的步骤中，还包括：融合表达血凝素标签用于后续检测。
[0019]第三方面，本申请提供靶向HSP70的纳米抗体在制备用于表达HSP70肿瘤组织的显影剂中的应用。
[0020]进一步，所述显影剂包括成像剂、示踪剂中的至少一种。
[0021]第四方面，本申请提供靶向HSP70的纳米抗体在制备靶向治疗HSP70表达的肿瘤疾病的药物中的应用。
[0022]第五方面，本申请提供靶向HSP70的纳米抗体在制备蛋白降解靶向联合体药物中的应用。
[0023]本申请第一方面提供一种靶向HSP70的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb D8，其中，所述纳米抗体Nb D8的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，由于提供的纳米抗体Nb D8能够与HSP70高度结合，与HSP70具有较高的亲和力和特异性，因此，通过纳米抗体Nb D8可靶向作用于HSP70，为后续的PROTAC复合物构建提供夯实的理论基础，同时这一全新概念的提出为临床提供了全新的治疗策略。
[0024]本申请第二方面提供的靶向HSP70的纳米抗体的制备方法，该制备方法通过高容量纳米抗体噬菌体文库进行筛选，得到的纳米抗体具有结合力强、特异性好的优点，且该制备方法简单方便，有利于广泛应用。
[0025]本申请第三方面提供的靶向HSP70的纳米抗体在制备用于表达HSP70肿瘤组织的显影剂中的应用。由于纳米抗体Nb D8与HSP70具有高亲和力和高结合特异性，因此，提供靶向HSP70的纳米抗体Nb D8进行表达HSP70肿瘤组织的显影剂的制备，有利于提高显影速度，有利于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向HSP70的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb D8，其中，所述纳米抗体Nb D8的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向HSP70的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述纳米抗体Nb D8中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的靶向HSP70的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体NbD8的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。4.一种如权利要求1～3任一所述的靶向HSP70的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：设计并合成HSP70
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NBD基因并及进行表达纯化，得到HSP70
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NBD蛋白；将...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志杰，孙继超，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：