核糖核酸的无细胞生成制造技术

在一些方面，本文中提供了用于核糖核酸的无细胞生成的方法和组合物。

Acellular formation of ribonucleic acid

In some respects, the method and composition for the acellular generation of ribonucleic acid are provided in this article.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核糖核酸的无细胞生成相关申请本申请要求2015年3月30日提交的美国临时申请号62/140,407的35U.S.C.§119(e)下的优先权，其全部内容通过引用并入本文。专利技术背景RNA干扰(RNAi)是指使用基因的DNA序列使基因“关闭”的细胞机制-一种称为“沉默”的过程。在极其多种生物体(包括动物、植物、和真菌)中，RNAi由双链RNA(dsRNA)触发。已经在活细胞中和体外使用纯化的重组酶和纯化的核苷酸三磷酸生成双链RNA(例如治疗性dsRNA)(参见例如欧洲专利号1631675A1和美国专利申请公开号US2014/0271559A1)。然而，使用此类系统的dsRNA的大规模生产是挑战性的、低效的且昂贵的。专利技术概述本文中提供了用于RNA(包括dsRNA)的无细胞生成(也称为生物合成)的平台。本公开的方法、组合物(例如，细胞和细胞裂解物)、和系统基于涉及将聚合RNA(例如，mRNA、tRNA和/或rRNA)无细胞(例如，使用细胞裂解物)降解成单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体的方法。在RNA降解后，将单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体转化为核糖核苷酸三磷酸，然后将核糖核苷酸三磷酸聚合形成期望的RNA(例如dsRNA)。因此，本公开提供了生成用于核糖核酸(RNA)的无细胞生成的细胞裂解物的方法。所述方法可以包括：(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶(例如，S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、或RNA酶R)的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶(例如，RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、和/或RNA酶T)遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚和NMP和NDP磷酸化的条件下温育所述第一细胞裂解物，从而生成含有核苷酸5’-单磷酸(或核苷酸5’-单磷酸和核苷酸5’-二磷酸的混合物)的第一细胞裂解物。在一些实施方案中，方法还包括(d)培养细胞，所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子，所述关联蛋白酶切割所述核酸酶或靶向性内源RNA酶的蛋白酶识别位点，其中所述关联蛋白酶(例如，人鼻病毒3C蛋白酶)与周质靶向序列连接，(ii)至少一种工程化核酸，其含有与编码核苷酸激酶(例如，尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、腺苷酸激酶、核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶)的序列可操作连接的启动子，(iii)至少一种工程化核酸，其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子，和(iv)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，其含有与编码RNA转录物的序列可操作连接的启动子，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞，以生成第二细胞裂解物。在一些实施方案中，方法还包括组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐和/或葡萄糖，从而生成混合物；并且在导致RNA(例如dsRNA)生成的条件下温育所述混合物。在一些实施方案中，方法包括(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，和(ii)至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核苷酸激酶的序列可操作连接的启动子，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚的条件下在将所述第一细胞裂解物与多磷酸盐和/或葡萄糖一起温育，从而生成含有核苷酸5’-三磷酸的混合物的第一细胞裂解物。在一些实施方案中，方法还包括(d)培养细胞，所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子，所述关联蛋白酶切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点，其中所述关联蛋白酶与周质靶向序列连接，(ii)至少一种工程化核酸，其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子，和(iii)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，所述工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板含有与编码RNA转录物的序列可操作连接的启动子，所述RNA转录物包含通过铰接域连接的互补域，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞，以生成第二细胞裂解物。在一些实施方案中，方法还包括组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐和/或葡萄糖，从而生成混合物；并且在导致RNA生成的条件下温育所述混合物。本文中还提供了工程化细胞和细胞裂解物，其包含含有蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接的核酸酶、核苷酸激酶、和核苷酸5’-单磷酸和核苷酸5’-二磷酸的混合物。本文中进一步提供了包含RNA聚合酶的工程化细胞和细胞裂解物，以及编码RNA的工程化DNA模板。本公开的一些方面提供了生成核糖核酸(RNA)的无细胞方法，所述方法包括(a)将第一细胞裂解物与第二细胞裂解物组合，其中所述第一细胞裂解物包含(i)包含蛋白酶识别位点的核酸酶，和(ii)核苷酸5’-单磷酸，和所述第二细胞裂解物包含(iii)切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点的关联蛋白酶、(iv)核苷酸激酶、(v)RNA聚合酶、和(vi)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，其含有与编码感兴趣的RNA的序列可操作连接的启动子，从而形成反应混合物；并且(b)在导致所述感兴趣的RNA(例如，感兴趣的双链RNA)生成的条件下温育所述反应混合物。在一些实施方案中，方法包括(a)将第一细胞裂解物与第二细胞裂解物组合，其中所述第一细胞裂解物包含(i)包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接的核酸酶、(ii)核苷酸激酶和多磷酸盐和/或葡萄糖、和(iii)核苷酸5’-三磷酸，和所述第二细胞裂解物包含(iv)切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点的关联蛋白酶、(v)RNA聚合酶、和(vi)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，所述工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板含有与编码感兴趣的RNA的序列可操作连接的启动子，从而形成反应混合物；并且(b)在导致所述感兴趣的RNA(例如，感兴趣的双链RNA)生成的条件下温育所述反应混合物。在本文中提供的任何一个实施方案中，细胞裂解物或反应混合物可以没有核酸酶活性。在附图和详细描述中阐述了本专利技术的几个实施方案的细节。从说明书和权利要求书中，本专利技术的其它特征、目的和优点将是显而易见的。附图简述图1显示了双链核糖核酸(dsRNA)生物合成方法的实例的流程图。在该实例中，一个群体的细胞表达工程化的RNA特异性核酸酶(其在周质中隔绝)，和至少一种工程化蛋白酶靶向性内源RNA酶。另一个群体的细胞表达工程化的DNA依赖性RNA聚合酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(隔绝到周质的工程化位点特异性蛋白酶)、至少一种蛋白酶靶向性内源RNA酶、和编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
生成用于核糖核酸(RNA)的无细胞生成的细胞裂解物的方法，所述方法包括：(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚的条件下温育所述第一细胞裂解物，从而生成含有核苷酸5’‑单磷酸的第一细胞裂解物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.30 US 62/140,4071.生成用于核糖核酸(RNA)的无细胞生成的细胞裂解物的方法，所述方法包括：(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚的条件下温育所述第一细胞裂解物，从而生成含有核苷酸5’-单磷酸的第一细胞裂解物。2.权利要求1的方法，其中所述与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子是诱导型的。3.权利要求1或2的方法，其还包括：(d)培养细胞，所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，其含有与编码关联蛋白酶(cognateprotease)的序列可操作连接的启动子，所述关联蛋白酶切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点，其中所述关联蛋白酶与周质靶向序列连接，(ii)至少一种工程化核酸，其含有与编码核苷酸激酶的序列可操作连接的启动子，(iii)至少一种工程化核酸，其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子，和(iv)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，其含有与编码RNA的序列可操作连接的启动子，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞，以生成第二细胞裂解物。4.权利要求3的方法，其中(d)(i)、(d)(ii)或(d)(iii)所述的启动子中的至少一种是诱导型的。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述核酸酶选自下组：S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、和RNA酶R。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述细胞含有至少一种蛋白酶靶向性内源核糖核酸酶和/或编码内源核糖核酸酶的基因中的至少一种染色体缺失。7.权利要求6的方法，其中至少一种内源核糖核酸酶选自下组：RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、RNA酶T、RNA酶E及其组合。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述核苷酸激酶是核苷酸单磷酸激酶。9.权利要求8的方法，其中所述核苷酸单磷酸激酶选自下组：尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、和腺苷酸激酶。10.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述核苷酸激酶是核苷酸二磷酸激酶。11.权利要求10的方法，其中所述核苷酸二磷酸激酶选自下组：核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶。12.权利要求1的方法，其中在所述细胞中使至少一种降解多磷酸盐的内源酶遗传失活。13.权利要求12的方法，其中所述降解多磷酸盐的内源酶中的至少一种选自下组：核苷单磷酸酶(又名5’-核苷酸酶)、核苷二磷酸酶、核苷三磷酸酶、核苷三磷酸磷酸水解酶(phosphohyrolase)、和外切聚磷酸酶。14.权利要求12或13的方法，其中所述细胞含有至少一种降解多磷酸盐的蛋白酶靶向性酶和/或编码降解多磷酸盐的酶的基因中的至少一种染色体缺失。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述RNA聚合酶是DNA依赖性RNA聚合酶。16.权利要求15的方法，其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。17.权利要求15或16的方法，其中所述工程化DNA模板的序列编码含有通过铰接域连接的互补域的mRNA。18.权利要求17的方法，其中所述启动子是T7启动子，并且其中T7转录终止子位于序列的3’端，所述序列编码所述含有通过铰接域连接的互补域的mRNA。19.权利要求3-14中任一项的方法，其中步骤(d)的所述细胞包含至少两种工程化核酸，各自含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子，其中所述工程化核酸之一编码DNA依赖性RNA聚合酶，并且所述工程化核酸之一编码RNA依赖性RNA聚合酶。20.权利要求19的方法，其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，并且所述RNA依赖性RNA聚合酶是Φ6RdRP。21.权利要求20的方法，其中所述工程化DNA模板的序列含有与序列可操作连接的启动子，所述序列编码含有单一靶域的mRNA。22.权利要求21的方法，其中所述启动子是T7启动子，并且T7转录终止子位于所述序列的3’端，所述序列编码所述含有单一靶域的mRNA。23.权利要求18-22中任一项的方法，其中所述工程化DNA模板位于含有内切核酸酶切割位点的表达载体上。24.权利要求23的方法，其中所述内切核酸酶切割位点是I-SceI内切核酸酶切割位点。25.权利要求23或24的方法，其中步骤(d)的所述细胞进一步包含编码内切...

【专利技术属性】
技术研发人员：WJ布莱克，DS坎宁安，D麦凯克兰，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US