金属离子传感器和检测金属离子的方法技术

一种构建金属离子结合基序的方法，其通过以下进行：鉴定特异性结合金属离子的金属离子结合肽，确定编码金属离子结合肽的核酸序列的至少一部分，将编码金属离子结合肽的核酸序列修剪成金属离子结合位点，鉴定宿主蛋白和宿主蛋白的核酸序列的相关部分，将编码金属离子结合肽的修剪的核酸序列与宿主蛋白核酸序列可操作地连接成金属离子结合基序序列，并表达金属离子结合基序序列，其中修剪编码金属离子结合肽的核酸序列以便获得具有对金属离子的所需特异性的金属离子结合基序。另外，由根据该方法构建的金属离子结合基序序列编码的蛋白质。

Metal ion sensors and methods for detecting metal ions

A method of constructing a metal ion binding motif, which is carried out by identification of specific binding of metal ions binding peptides, determine the encoding at least a portion of the metal binding peptide nucleic acid sequence, encoding metal ion binding peptide nucleic acid sequence trim to metal ion binding sites, related nucleic acid sequence identification of host proteins and host proteins, nucleic acid sequences encoding the metal ion binding and host protein peptide nucleic acid sequence trim operably connected to metal ion binding motif, and the expression of metal ion binding motif, the pruning encoding metal ion binding peptide nucleic acid sequences with metal ions in order to obtain the specific needs of the metal ion binding motif. In addition, the protein encoded by the metal ion binding sequence sequence constructed according to the method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】金属离子传感器和检测金属离子的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2013年8月6日提交的标题为“ANALYTESENSORS,METHODSFORPREPARINGANDUSINGSUCHSENSORS,ANDMETHODSOFDETECTINGANALYTEACTIVITY”的美国临时专利申请序列号：61/862,663、于2014年1月3日提交的标题为“ANALYTESENSORS,METHODSFORPREPARINGANDUSINGSUCHSENSORS,ANDMETHODSOFDETECTINGANALYTEACTIVITY”的美国临时专利申请序列号：61/923,252的优先权，其全文内容通过引用并入本文中。
本公开内容涉及用于检测金属离子分析物的工程化蛋白金属离子传感器，和它们在体内和体外的使用方法，所述工程化蛋白金属离子传感器包含被工程化到荧光多肽中的金属离子结合位点。序列表本公开内容包括通过引入全文并入本文的序列表。背景钙瞬变(calciumtransient)源自跨生物膜的钙浓度梯度，并且由钙结合亲和力与钙通道/泵和细胞内钙结合蛋白的动力学来确定。时空钙浓度变化导致不同的生理信号转导，包括肌肉收缩、心脏跳动、神经递质释放和基因表达等(ClaphamDE(2007)Cell131:1047-1058；Berridge等人,(1998)Nature395:645-648；BerridgeMJ(1998)Neuron21:13-26；Bers&Guo(2005)Ann.N.Y.Acad.Sci.1047:86-98；SpitzerNC(2008)Nat.Neurosci.11:243-244)。钙信号传导的时间尺度是多种多样的，范围从毫秒到分钟。由于经由膜电压门控钙通道的钙流入和从内部存储的钙释放，快速钙信号传导尤其与动作电位相关的快速钙信号传导，通常伴随快速局部钙上升(毫秒)发生，例如在肌肉细胞中的兴奋-收缩耦连(EC耦连)和在神经元细胞中的神经元递质释放(BerridgeMJ(1998)Neuron21:13-26；Rios&Pizarro(1991)Physiol.Rev.71:849-908；SchneiderMF(1994)Ann.Rev.Physiol.56:463-484；Baylor&Hollingworth(2003)J.Physiol.551:125-138；BeanBP(2007)Nat.Revs.Neurosci.8:451-465；Locknar等人,(2004)J.Physiol.555:627-635；Sandler&Barbara(1999)J.Neurosci.19:4325-4336；Borst&Sakmann(1999)Philosoph.TransR.Soc.London.SeriesB,Biol.Sci.354:347-355；Lopez-Lopez等人,(1995)Science268:1042-1045；Cannell等人,(1995)Science268:1045-1049；Polakova等人,(2008)J.Physiol.586:3839-3854；Fill&Copello(2002)Physiol.Rev.82:893-922)。缓慢钙信号传导通常发生在诸如免疫反应的细胞事件中，这可以持续数分钟至数小时。在缓慢钙信号传导途径中，钙瞬变由几个因素和第二信使(如DAG、IP3和ATP)控制，涉及更复杂的调节机制。为了在动力学、幅度和持续时间方面准确监测钙瞬变，需要钙指示剂具有几个关键性质。必要的是将钙指示剂的解离平衡常数Kd与102s-1数量级的亚细胞隔室的静息钙浓度匹配。为了检测来自肌肉和神经元细胞钙池(calciumpool)中的快速钙释放，在0.1-1mM范围内的钙结合亲和力和指示剂大于500s-1的钙解离速率是必要的。基因编码的指示剂(GECI)的开发允许实时探测时空细胞事件和细胞信号传导。GECI是一个大家族，包括但不限于GCaMP、GECO、TN和Cameleon系列。它们包括荧光蛋白部分，并利用天然细胞溶质钙结合蛋白(CBP)钙调蛋白(CaM)或肌钙蛋白C(TnC)来感测钙和钙诱导的总体构象重排。每个CaM或TnC可以以协作方式结合四个钙离子，具有在细胞溶质钙变化时的高钙结合亲和力(Kd＝10-7M)并且它们的钙结合的结合速率(calcium-bindingonrate)在107M-1s-1的数量级。高钙结合亲和力和结合速率使它们能够感测在细胞溶质中的直接[Ca2+]上升。然而，可能由于与多个钙结合位点协作缔合和多层构象变化，这些GECI具有约0.1-10s-1的缓慢解离速率。信号衰减的缓慢动力学对探测生理快速钙瞬变尤其在神经元细胞和骨骼肌细胞中的快速钙瞬变不利。因此，已经作出努力以减少钙结合亲和力。一个典型的例子是CameleonD1ER，其具有约0.8和60μM的多重Kd和约256s-1的解离速率。然而，它仍然不足够快以捕获在小鼠FDB纤维中刺激后来自肌质网(SR)的钙释放。概述因此，为了实现快速的钙指示剂的未满足的需要，在不通过将钙结合位点工程化到单个荧光蛋白EGFP中而掺入天然钙结合结构域的情况下，产生钙指示剂，命名为“CatchER”。钙结合化学计量为1：1，且体外Kd为0.18mM，原位校准的Kd为0.8mM，允许测量在不同细胞系中的基础钙及其响应不同药物的变化。相比CameleonD1ER，CatchER呈现更快的动力学，使其在骨骼肌细胞中能够捕捉在SR中的钙变化。本方法提供了通过定点诱变在可用于组织和动物成像的荧光物上创建钙结合位点来设计钙结合+生物传感器，以精确测量细胞中的实时钙离子浓度。提供了具有不同信号肽和多个数量级的结合亲和力的增强的传感器，其可以帮助检测在不同细胞类型的不同亚细胞器中对不同激动剂的Ca2+信号传导响应。因此，本公开内容的一个方面涵盖多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽(RFP)，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述金属离子结合位点与所述工程化RFP的发色团区域协作相互作用，使得当所述传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，并且其中所述金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值。本公开内容的另一个方面涵盖重组核酸的实施方案，所述重组核酸具有与选自由SEQIDNO：7-36组成的组的序列至少95％的相似性或将多肽金属离子传感器编码成选自由SEQIDNO：41-63组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列。本公开内容的另一个方面涵盖多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化绿色荧光多肽(GFP)，其中所述工程化GFP为具有与氨基酸序列SEQIDNO：37至少90％相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述异源金属离子结合位点与所述工程化红色荧光多肽的发色团区域协作相互作用，使得当所述多肽金属离子传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述多肽金属离子传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，其中所述多肽金属离子传感器具有至少10s

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.06 US 61/862,663;2014.01.03 US 61/923,2521.一种多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述异源金属离子结合位点与所述工程化红色荧光多肽的发色团区域协作相互作用，使得当所述多肽金属离子传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述多肽金属离子传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，其中所述多肽金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值，其中所述工程化红色荧光多肽的氨基酸序列为SEQIDNo:41-45、48或56。2.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述多肽金属离子传感器被缀合到特异性识别细胞的结构特征的至少一个靶向多肽基序。3.根据权利要求2所述的多肽金属离子传感器，其中所述至少一个靶向多肽基序特异性识别细胞的内质网或肌质网的靶组分。4.根据权利要求2-3的任一项所述的多肽金属离子传感器，其中所述至少一个靶向多肽基序的序列选自SEQIDNO：64、76-78和序列KDEL。5.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述异源金属离子结合位点特异性结合选自由以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、镁、汞和镉。6.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号在强度、波长和寿命中的至少一个中不同。7.一种重组核酸，所述重组核酸的核苷酸序列将多肽金属离子传感器编码成选自由SEQIDNO：41-45、48和56组成的组的氨基酸序列。8.一种重组核酸，所述重组核酸的核苷酸序列是SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹妮·杰·杨，唐申，优乔伊·卓，
申请(专利权)人：佐治亚州立大学研究基金会公司，
类型：发明
国别省市：美国,US