重组溶瘤病毒制造技术

公开了重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码被插入在RNA病毒基因组内的第二线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(Smac)蛋白的核酸，其中Smac蛋白特异性地结合至凋亡抑制蛋白(IAP)的至少一部分。还公开了使用所公开的载体治疗癌症的方法。

Recombinant oncolytic virus

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组溶瘤病毒相关申请的交叉引用本申请要求于2017年5月19日提交的美国临时申请号62/508,430的权益，该申请特此通过引用以其整体并入本文。背景自噬是溶酶体中捕获、降解和回收细胞内蛋白质和细胞器的存活促进途径。自噬在癌症中具有双重作用，充当通过防止受损的蛋白质和细胞器的积累的肿瘤抑制因子和充当可以促进建立的肿瘤的生长的细胞存活的机制两者。存在大量证据指示，自噬在癌症生物学中起着核心作用(Lippai,M.和Z.Szatmari,CellBiolToxicol,201733(2):145-168)。一方面，正常细胞的自噬可以抑制肿瘤发生。癌症的突变可以导致自噬功能的丧失。可选择地，自噬也可以使得肿瘤细胞对抗癌药物的治疗耐受。自噬和凋亡之间的交叉对话(cross-talk)在癌症生物学中也是关键的，但是该两个途径之间的关系是复杂的。需要破坏自噬的保护机制的方法，因此凋亡可以更容易地被诱导。概述本文公开了重组病毒载体，该重组病毒载体包含编码被插入在溶瘤病毒基因组内的治疗基因的核酸，其中治疗基因在病毒感染期间的表达引起肿瘤细胞的死亡。特别地，本文公开了重组病毒载体，该重组病毒载体包含编码第二线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(Smac)蛋白(也被称为DIABLO)的核酸，该第二线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(Smac)蛋白特异性地结合至凋亡抑制蛋白(IAP)的至少一部分。编码Smac的核酸作为基因盒被插入在RNA病毒基因组内，以在病毒感染期间表达Smac蛋白。在一些情况下，Smac蛋白是全长Smac蛋白。在一些情况下，Smac蛋白缺乏线粒体靶向序列(Δ55Smac)。在一些情况下，RNA病毒基因组还包含表达微RNA-155的盒。在一些实施方案中，病毒是非节段负链RNA病毒(NNSV)。在一些实施方案中，病毒是在哺乳动物中传播的单股负链病毒目(orderofMononegavirales)中的任何病毒。在一些实施方案中，病毒是在哺乳动物中传播的弹状病毒科(familyofrhabdoviridae)中的任何病毒。例如，在一些实施方案中，病毒是水疱病毒属(Vesiculovirus)中的任何病毒。在一些情况下，病毒包含水疱性口炎病毒(VSV)(印第安纳水疱病毒(Indianavesiculovirus))。在一些实施方案中，病毒是在哺乳动物中传播的副粘病毒科(familyofparamyxoviridae)中的任何病毒。例如，在一些实施方案中，病毒是亨尼帕病毒属(Henipavirus)中的任何病毒。在一些实施方案中，病毒是麻疹病毒属(Morbillivirus)中的任何病毒。在一些实施方案中，病毒是呼吸道病毒属(Respirovirus)中的任何病毒。在一些实施方案中，病毒是腮腺炎病毒属(Rubulavirus)中的任何病毒。在一些情况下，溶瘤病毒包含水疱性口炎病毒(VSV)。在一些情况下，病毒包含麻疹病毒(MV)。在一些情况下，病毒包含流感病毒(IFV)。在一些实施方案中，病毒是正链RNA病毒(PSV)，诸如小核糖核酸病毒(picornavirus)或α病毒(alphaviruses)。在一些情况下，病毒包含脊髓灰质炎病毒(PV)。在一些情况下，病毒包含柯萨奇病毒(CV)。在一些情况下，病毒包含辛德比斯病毒(Sindbisvirus)(SINV)。smac基因可以被插入病毒基因组中的任何地方，只要它被表达。在优选的实施方案中，smac基因被插入，使得其表达被延迟直到病毒复制之后。VSV基因组包含核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因、基质蛋白(M)基因、糖蛋白(G)基因和大(L)聚合酶蛋白。VSV基因的mRNA水平在VSV感染中从N基因(接近3’末端)下降至L基因(接近5’末端)。N蛋白和P蛋白是用于支持病毒复制所需的，而M蛋白是用于病毒组装所需的。因此，在一些实施方案中，smac基因在N基因、P基因和M基因之后被插入到VSV基因组中，使得Smac仅当病毒产生被良好地建立时达到显著水平。在一些情况下，smac基因被插入在来自单股负链病毒目的病毒中的M基因之后。其他病毒基因组内的可比位置可以被确定并且被用于所公开的载体中。在一些实施方案中，Smac蛋白包含全长Smac蛋白。例如，在一些实施方案中，Smac蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:1，或其保守变体，所述保守变体特异性地结合IAP。在其他实施方案中，Smac蛋白缺乏线粒体靶向序列。例如，在一些实施方案中，Smac蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:2，或其变体，所述变体特异性地结合IAP。当病毒在病毒进入期间被暴露于内体中的低pH时，VSV糖蛋白(G)负责附着至宿主受体并且诱导膜融合。在一些实施方案中，靶向结构域被插入到G蛋白中，使得修饰的G蛋白可以将VSV靶向癌症。例如，靶向蛋白质结构域可以是长度为六个氨基酸或更少的蛋白质序列，该蛋白质序列可以选择性地结合在癌细胞的表面上显示的蛋白质。αv整联蛋白和整联蛋白a5β1识别其相应的配体上的RGD序列。因此，在一些实施方案中，靶向序列包含结合整联蛋白(integrinprotein)的RGD序列。因此，在一些实施方案中，VSVG蛋白具有氨基酸序列SEQIDNO:6。在一些实施方案中，重组载体包含核酸序列SEQIDNO:8、9、10、或11，或者其变体，该变体产生在癌细胞中感染的病毒颗粒并且产生结合IAP的Smac蛋白。还公开了细胞，所述细胞包含所公开的重组载体。还公开了重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒包含所公开的重组载体。还公开了组合物，所述组合物包含在药学上可接受的赋形剂中的所公开的重组病毒颗粒。本文还公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含所公开的重组病毒颗粒的组合物。所公开的方法可以用于治疗多种肿瘤，包括卵巢肿瘤、肝脏肿瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、胃肿瘤和脑肿瘤。本专利技术的一种或更多种实施方案的细节在以下的附图和描述中阐述。本专利技术的其他特征、目标和优点将从说明书和附图，以及从权利要求而明显。附图说明图1A是示出了Smac插入物在最初编码五个病毒基因的VSV基因组中的位置的图。图1B示出了用于侧接Smac插入物的序列(示出了第一Met和终止密码子)。CT在3’末端处作为另外的基因连接被添加。图2示出了在HeLa细胞中生长至相似的滴度(MOI＝0.01)的wtVSV和VSV-S。图3示出了VSV-S和wtVSV感染的HeLa细胞的蛋白印迹分析。图4A示出了，在感染24小时之后，大多数T-47D细胞被表达mCherryP的wtVSV感染(红色荧光，右上图)，但是没有死亡。图4B示出了，在感染48小时之后，超过60％的T-47D细胞被VSV-S杀死，而大多数细胞从被wtVSV感染中存活。图5A描绘了Panc02模型中的肿瘤生长。图5B描绘了在9天结束时肿瘤重量的差异。图6A示出了犬肛门囊癌的wtVSV(红色)感染的组织的成像。(B)PARP的裂解产物(绿色染色)示出了，与wtVSV相比，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组病毒载体，包含编码被插入在RNA病毒基因组内的第二线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(SMAC)蛋白的核酸，其中所述SMAC蛋白特异性地结合至凋亡抑制蛋白(IAP)的至少一部分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170519 US 62/508,4301.一种重组病毒载体，包含编码被插入在RNA病毒基因组内的第二线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(SMAC)蛋白的核酸，其中所述SMAC蛋白特异性地结合至凋亡抑制蛋白(IAP)的至少一部分。


2.如权利要求1所述的重组载体，其中所述病毒是弹状病毒。


3.如权利要求2所述的重组载体，其中所述病毒包含水疱性口炎病毒(VSV)。


4.如权利要求3所述的重组载体，其中所述病毒基因组包含至少核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因和基质蛋白(M)基因，其中编码SMAC的所述核酸被插入在所述M基因之后。


5.如权利要求4所述的重组载体，其中所述病毒基因组包含糖蛋白(G)基因，所述糖蛋白(G)基因编码包含插入的癌症靶向结构域的修饰的G蛋白。


6.如权利要求5所述的重组载体，其中所述靶向结构域包含结合整联蛋白的RGD序列。


7.如权利要求6所述的重组载体，其中所述G蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:6。


8.如权利要求1至7中任一项所述的重组载体，其中所述SMAC蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:1，或其保守变体，所述保守变体特异性地结合IAP。

【专利技术属性】
技术研发人员：罗明，
申请(专利权)人：佐治亚州立大学研究基金会公司，
类型：发明
国别省市：美国;US