昆虫侵袭的控制制造技术

本文提供了使用靶向蛋白酶体β5(PSMB5)基因的RNAi分子来控制鞘翅目昆虫的方法、产生靶向PSMB5的RNAi分子的方法和包含靶向PSMB5的RNAi分子的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】昆虫侵袭的控制相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,217的权益，其全部内容通过引用并入本文。专利技术背景作物往往是昆虫袭击的目标。根据联合国粮农组织，由于有害生物和疾病，全球农民损失其作物的30％至40％。作物维持和作物健康对于产品的产率和质量至关重要，这最终需要制定长期策略以使有害生物和疾病的发生最小化。控制作物有害生物(如，鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等)的年成本估计为数千万美元，如果不加以控制，预计每年的作物损失成本将达到数十亿美元。虽然化学农药(pesticide)已成为根除有害生物侵袭的一种解决方案，但仍需要更环保的替代解决方案。化学农药对环境有害，并且可能缺乏特异性或选择性，最终导致非目标效应。此外，鉴于化学农药代谢缓慢以及化学农药积累的可能性，很可能会出现抗性。因此，长期以来一直需要更环保的控制或根除昆虫侵袭的方法，其是更具选择性、环境安全和可生物降解的。专利技术概述一些方面，本公开提供了用于控制对作物植株造成损害的有害生物(如，鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)和/或双翅目(Diptera)昆虫)侵袭的组合物、遗传构建体和方法。例如，本公开一些方面提供了包含用于控制这些有害生物侵袭作物的干扰RNA分子(如，双链RNA)的组合物。本公开的方面还提供了用于控制有害生物的方法，包括但不限于杀死有害生物、抑制有害生物的生长和发育、改变有害生物的生育力或生长以使得有害生物对作物植株造成较少损害，减少有害生物产生的后代数量，产生不太适应的有害生物，减少昆虫侵袭群体，产生更容易受到捕食者攻击的有害生物，或阻止有害生物食用作物植株。为了减少对广谱化学杀虫剂的依赖及其相关问题，需要降低风险的农药。提供昆虫有害生物控制的降低风险的方法的希望的新技术是RNA干扰(RNAi)。在一些实施方案中，本公开提供了基于RNAi的技术，其可通过递送靶向(如，结合)和干扰昆虫(如，科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotatobeetle)蛋白酶体β5(PSMB5)基因)的信使RNA(mRNA)的核糖核酸(RNA)干扰(RNAi)分子来减轻昆虫(如，科罗拉多马铃薯甲虫)损害。蛋白酶体β5，是蛋白酶体(负责细胞内蛋白降解的复合物)的亚基，主要通过催化多肽链中内部α-肽键的水解来影响内肽酶活性。蛋白酶体β5具有致命和复杂的表型，涉及生理学多个方面的破坏，包括如下的化学反应和途径，所述化学反应和途径通过对蛋白或肽的肽键水解将其分解，由泛素的共价连接引发并且由蛋白酶体介导。实验室研究证实，作用模式通过RNAi加工进行的RNA分子(如，双链RNA(dsRNA))的口服递送对许多昆虫物种有效，因此，局部dsRNA被认为是合适的递送形式。然而，喷雾式dsRNA昆虫有害生物控制技术现在还不存在。以相对较低的价格生产dsRNA的成本是农业生物技术(Ag-Bio)产业的主要挑战。对于农业有害生物，可表达杀虫dsRNA的转基因植物可以保护植物免受昆虫取食。然而，并非所有国家都接受遗传修饰的作物，并且正在考虑将dsRNA喷雾应用作为替代的保护递送方法。为了鉴定RNAi敲低的靶标，将全基因组信息用于在目标物种(如，马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata))中鉴定PSMB5的适当基因序列，其在被选择性沉默时控制这些关键有害生物，而不会不利影响马铃薯农业生态系统的非目标物种。考虑到感兴趣的DNA序列和输出序列的设计标准规则集，适当的计算算法与公开可用的RNAi设计工具相结合，以创建满足这些标准的输出序列。通过搜索拟谷盗属(Tribolium)和果蝇属(Drosophila)基因组的综合序列数据库(如Flybase、SnapDragon、Beetlebase等)，鉴定了选择设计dsRNA的原始/初始区域。公开可用的E-RNAi工具(可用于使用基于预测siRNA的方法设计dsRNA)与专有算法相结合，以创建设计工作流程。然后可将该设计工作流程用于创建(a)期望的长度，(b)与原始序列的期望百分比同一性(通过引入随机突变)，以及(c)通过将初始PSMB5基因序列分成多个片段得到的特定长dsRNA序列。在一些实施方案中，RNAi分子包括单链RNA(ssRNA)，并且在一些实施方案中，RNAi分子包括双链RNA(dsRNA)或部分dsRNA。在其他实施方案中，RNAi分子可以是具有包含明显双链特征的二级结构的单链RNA分子，例如但不限于发夹RNA。本公开提供用于靶向PSMB5mRNA的RNA，例如单链RNA(ssRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)或双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，PSMB5RNA有效降低昆虫中的PSMB5表达、使幼虫发育迟缓、抑制昆虫的生长、繁殖(如，生育力和/或繁殖力)和/或修复、杀死幼虫或昆虫、以及减少昆虫的进食。因此，本公开的一方面提供了控制昆虫的方法，其包括向植物和/或昆虫递送(如，使植物和/或昆虫接触)有效量的靶向PSMB5的RNA。PSMB5RNA对于控制鞘翅目昆虫(如，科罗拉多马铃薯甲虫)特别有用，从而减少和/或防止侵袭作为人类主要食物来源的某些植物(如，马铃薯)。本公开的一些方面还提供了产生靶向PSMB5的RNA的无细胞方法，该方法包括：(a)在适合产生5'核苷单磷酸(5'NMP)的条件下，在反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶；(b)消除核糖核酸酶；和(c)在适合于自DNA产生靶向PSMB5的RNA的条件下温育反应混合物或在第二反应混合物中温育5'NMP、多磷酸激酶、多磷酸盐、聚合酶和DNA(又被称为DNA模板)中温育。本文还提供包含靶向PSMB5的RNA的组合物。在一些实施方案中，包含靶向PSMB5的RNA的组合物进一步包含添加剂，例如化学品、农药、表面活性剂、生物成分或其他非农药成分。在一些实施方案中，在表达载体中提供靶向PSMB5的RNA。在一些实施方案中，在植物或植物细胞中提供靶向PSMB5的RNA。应当理解，“靶向PSMB5的RNAi分子”包括“靶向PSMB5编码的mRNA的RNAi分子”。如果RNAi分子结合(如，瞬时结合)并抑制(减少或阻断)mRNA的翻译，例如由于mRNA被降解，则认为RNAi分子靶向感兴趣的基因。在一些实施方案中，如果存在表观遗传变化，则RNAi分子可抑制由感兴趣的基因编码的mRNA的表达。还应当理解，在一些实施方案中，多核苷酸是抑制基因(如，PSMB5)编码区表达的双链RNA(如，dsRNA)。在其他实施方案中，多核苷酸是编码dsRNA的DNA序列。在其他实施方案中，多核苷酸是反义RNA。应当理解，本文作为DNA序列公开的序列可通过用尿嘧啶替换每个胸苷而从DNA序列转化为RNA序列。附图简述图1A-1B包括图，该图显示将科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)暴露于本公开的PSMB5RNAi(GS2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目蛋白酶体β5(PSMB5)基因的表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181108 US 62/757,2171.多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目蛋白酶体β5(PSMB5)基因的表达。


2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述鞘翅目PSMB5基因包含SEQIDNO:1的脱氧核酸(DNA)序列。


3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是核糖核酸(RNA)。


4.权利要求3所述的多核苷酸，其中所述RNA是双链RNA(dsRNA)，其包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的信使RNA(mRNA)互补的第一链和与所述第一链互补的第二链。


5.权利要求4所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQIDNO:18的RNA序列。


6.权利要求4或5所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA或mRNA区段70％至100％互补的RNA序列。


7.权利要求6所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA或mRNA区段75％至80％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％、或98％至100％互补的RNA序列。


8.权利要求7所述的多核苷酸，其中所述mRNA区段具有至少18至500个核苷酸、至少21至500个核苷酸、至少50至500个核苷酸、至少100至500个核苷酸、或至少200至500个核苷酸的长度。


9.权利要求4至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA或mRNA区段至少90％至100％、95％至100％、或至少98％至100％互补的至少18至21个连续核苷酸。


10.权利要求4至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQIDNO:35的RNA序列或RNA序列区段具有70％至100％同一性的RNA序列。


11.权利要求10所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQIDNO:35的RNA序列或RNA序列区段具有75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％、或98％至100％同一性的RNA序列。


12.权利要求10或11所述的多核苷酸，其中所述SEQIDNO:35的RNA序列区段具有至少18至500个核苷酸、至少21至500个核苷酸、至少50至500个核苷酸、至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸的长度。


13.权利要求10至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQIDNO:35的RNA序列具有至少90％至100％、95％至100％、或至少98％至100％同一性的至少18至21个连续核苷酸。


14.权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述RNA是与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA结合的单链RNA(ssRNA)。


15.权利要求14所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQIDNO:18的RNA序列。


16.权利要求14或15所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA或mRNA区段70％至100％互补的RNA序列。


17.权利要求16所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目PSMB5基因编码的mRNA或mRNA区段75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％、或98％至100％互补的RNA序列。


18.权利要求17所述的多核苷酸，其中所述mRNA区段具有至少18至500个核苷酸、至少21至500个核苷酸、至少50至500个核苷酸、至少100至500个核苷酸、或至少200至500个核苷酸的长度。


19.权利要求14至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与所述mRNA至少90％至100％、95％至100％、或至少98％至100％互补的至少18至21个连续核苷酸。


20.权利要求14至19中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与SEQIDNO:36或SEQIDNO:39的RNA序列具有70％至100％同一性的RNA序列。


21.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：T巴罗斯罗德里格斯，S德赛，K斯里德哈兰，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US