鞘翅目昆虫的控制制造技术

本文提供了使用靶向凋亡抑制剂(IAP)基因的RNAi分子以控制鞘翅目昆虫的方法、产生靶向IAP的RNAi分子的方法以及包含靶向IAP的RNAi分子的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鞘翅目昆虫的控制相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年9月26日提交的美国临时申请号62/737,041的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotatobeetle)(Leptinotarsadecemlineata)是马铃薯作物的主要害虫。控制科罗拉多马铃薯甲虫的年成本估计为数千万美元，如果不控制科罗拉多马铃薯甲虫，作物损失的预计年成本达到数十亿美元。此外，控制科罗拉多马铃薯甲虫因其对多种化学品和杀虫剂的抗性而复杂化。因此，需要控制科罗拉多马铃薯甲虫的新途径。
技术实现思路
在一些方面，本公开提供了用于控制科罗拉多马铃薯甲虫侵袭的组合物、遗传构建体和方法。为了减少对广谱化学杀虫剂的依赖及其相关问题，需要降低风险的杀虫剂。RNA干扰(RNAi)是一项提供昆虫有害生物控制的降低风险方法的希望的新技术。在一些实施方案中，本公开提供了基于RNAi的技术，其可以通过递送靶向(例如，结合)并干扰科罗拉多马铃薯甲虫凋亡抑制剂(InhibitorofApoptosis，IAP)基因的信使RNA(mRNA)的核糖核酸(RNA)干扰(RNAi)分子来减轻科罗拉多马铃薯甲虫的损害。凋亡是细胞自杀的进化上保守的途径，其对于正常细胞发育和稳态至关重要。凋亡的关键调控因子为IAP。IAP发现于昆虫杆状病毒(苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydiapomonellagranulosisvirus)和黄杉毒蛾核型多角体病毒(Orgyiapseudotsugatanuclearpolyhedrosisvirus))中，并且后来在许多其它生物体诸如蚊虹彩病毒(mosquitoiridescentviruses)、昆虫、酵母和人类中也发现了IAP。许多IAP在其它物种的细胞中过表达时会阻断凋亡。通过RNA干扰敲低IAP的表达通常会诱导凋亡。参见，例如，PridgeonJWetal.JMedEntomol2008；45(3):414-420。实验室研究已证实，口服递送RNA分子(其作用方式为通过RNAi过程(例如，双链RNA(dsRNA)进行)对许多昆虫物种是有效的，因此，局部dsRNA被认为是合适的递送形式。然而，目前尚不存在喷洒dsRNA昆虫有害生物控制技术。以相对低的价格生产dsRNA的成本是Ag-Bio业的主要挑战。对于农业害虫，可以表达杀虫dsRNA的转基因植物可保护该植物免受虫食。然而，并非所有国家都接受基因修饰的作物，而dsRNA的喷雾施用被认为是一种保护的替代递送方法。为了鉴定RNAi敲低的靶标，利用全基因组信息鉴定了目标物种(科罗拉多马铃薯甲虫)中IAP的合适基因序列，其当被选择性沉默时可以控制这些关键有害生物，而不会对马铃薯农业生态系统中的非目标物种产生不利影响。鉴于目的DNA序列和输出序列的设计准则规则集，将适当的计算算法与公众可获得的RNAi设计工具相结合，以创建满足这些准则的输出序列。通过检索拟谷盗属(Tribolium)和果蝇属(Drosophila)基因组的综合序列数据库(例如，Flybase，SnapDragon，Beetlebase等)鉴定了选择用于设计dsRNA的原始/起始区域。将可用于使用预测的基于siRNA的方法设计dsRNA的公众可获得的E-RNAi工具与专有算法组合以创建设计工作流程。然后使用该设计工作流程来创建特定长dsRNA序列，与原始序列具有(a)所需长度，(b)所需百分比同一性(通过引入随机突变)以及(c)通过将初始IAP基因序列分割成多个片段得到。在一些实施方案中，RNAi分子包含单链RNA(ssRNA)，并且在一些实施方案中，RNAi分子包含双链RNA(dsRNA)或部分dsRNA。在其它实施方案中，RNAi分子可为具有二级结构的单链RNA分子，所述二级结构含有显著的双链特征，诸如但不限于发夹RNA。本公开提供了靶向IAPmRNA的RNA，例如单链RNA(ssRNA)，小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，信使RNA(mRNA)，短发夹RNA(shRNA)或双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，IAPRNA有效降低昆虫中的IAP表达，使幼虫发育迟缓(stunting)，抑制昆虫的生长、繁殖(例如，生育力(fertility)和/或繁殖力(fecundity))和/或修复，杀死幼虫或昆虫，以及减少昆虫的摄食。因此，本公开的一个方面提供了一种用于控制昆虫的方法，其包含递送有效量的靶向IAP的RNA给植物和/或昆虫(例如使它们接触)。IAPRNA尤其可用于控制鞘翅目(Coleopteran)昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)，从而减少和/或防止对作为人类主要食物来源的某些植物(例如，马铃薯)的侵袭。本公开的一些方面还提供了产生靶向IAP的RNA的无细胞方法，该方法包含：(a)在适于产生5′核苷单磷酸(5′NMP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶；(b)消除核糖核酸酶；以及(c)在适于从DNA产生靶向IAP的RNA的条件下温育该反应混合物，或在第二反应混合物中温育该5'NMP、多磷酸盐激酶、多磷酸盐、聚合酶和DNA(也称为DNA模板)。本文还提供了包含靶向IAP的RNA的组合物。在一些实施方案中，包含靶向IAP的RNA的组合物还包含添加剂，例如，化学品、农药、表面活性剂、生物或其它非农药成分。在一些实施方案中，在表达载体中提供靶向IAP的RNA。在一些实施方案中，在植物或植物细胞中提供靶向IAP的RNA。应当理解，“靶向IAP的RNAi分子”涵盖“靶向IAP编码的mRNA的RNAi分子”。如果RNAi分子结合(例如，瞬时结合)并抑制(减少或阻断)mRNA的翻译(例如，由于mRNA被降解)，则认为该RNAi分子靶向目的基因。在一些实施方案中，如果存在表观遗传改变，则RNAi分子可以抑制由目的基因编码的mRNA的表达。还应当理解的是，在一些实施方案中，多核苷酸为双链RNA(例如，dsRNAGS3)，其抑制基因(例如，IAP)的编码区的表达。在其它实施方案中，多核苷酸为编码dsRNA的DNA序列。在其它实施方案中，多核苷酸为反义RNA。应当理解，本文公开的作为DNA序列的序列可以通过用尿嘧啶替代每个胸腺嘧啶而从DNA序列转化为RNA序列。附图说明图1A-1B包括显示在将CPB暴露于本公开的IAPRNAi(GS3)组合物(含有靶向IAPmRNA的双链RNA(dsRNA))或对照RNAi(GS4)组合物(10μg/cm2浓度的RNAi)9天后，科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的死亡率百分比(图1A)和CPB的叶圆片消耗(leafdiscconsumption)百分比(图1B)的图。图2A-2B包括显示在CPB前三(3)天暴露于本公开的IAPRNAi组合物(1.0μg/cm2、0.1μg/cm2、0.01μg/cm2或0.001μg/cm2的GS3)或对照RNAi组合物(1.0μg/cm2的GS4)的八天剂量试验时间进程后，科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因的表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180926 US 62/737,0411.一种多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因的表达。


2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述鞘翅目IAP基因包含SEQIDNO：1的脱氧核酸(DNA)序列。


3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为核糖核酸(RNA)。


4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述RNA为双链RNA(dsRNA)，其包含与由鞘翅目IAP基因编码的信使RNA(mRNA)互补的第一链，以及与所述第一链互补的第二链。


5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQIDNO：19的RNA序列。


6.根据权利要求4或5所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段70％至100％互补的RNA序列。


7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％或98％至100％互补的RNA序列。


8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述mRNA的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。


9.根据权利要求4-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％互补。


10.根据权利要求4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQIDNO：37的RNA序列或所述RNA序列的区段具有70％至100％同一性的RNA序列。


11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQIDNO：37的RNA序列或所述RNA序列的区段具有75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，或98％至100％同一性的RNA序列。


12.根据权利要求10或11所述的多核苷酸，其中SEQIDNO：37的RNA序列的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。


13.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQIDNO：37的RNA序列具有至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％同一性。


14.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述RNA为单链RNA(ssRNA)，其与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA结合。


15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQIDNO：19的RNA序列。


16.根据权利要求14或15所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段70％至100％互补的RNA序列。


17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％或98％至100％互补的RNA序列。


18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述mRNA的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。


19.根据权利要求14-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与所述mRNA至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％互补。


20.根据权利要求14-19中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：T巴罗斯罗德里格斯，S德赛，K斯里德哈兰，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US