治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法技术

提供在宿主细胞中表达α1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物和方法。还提供用于治疗患有α1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的受试者的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法本申请案要求2018年10月18日提交的美国临时申请号62/747,522的优先权益。前述申请的说明书全文以引用方式并入本文。α-1抗胰蛋白酶(AAT或A1AT)或血清胰蛋白酶抑制剂是由SERPINA1基因编码的一类丝氨酸蛋白酶抑制剂(也被称为丝氨酸蛋白酶抑制因子)。AAT主要由肝细胞合成和分泌，并且用来抑制肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性。在没有足够数量的运作AAT的情况下，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶不受控制并且破坏肺部中的肺泡。因此，SERPINA1中的导致AAT水平减少、或正确地运作AAT的水平减少的突变导致肺部病状。此外，SERPINA1中的导致产生错误形成的AAT的突变由于AAT在肝细胞中的积累而导致肝脏病变。因此，由SERPINA1突变导致的不充足和不正确地形成的AAT可导致肺部和肝脏病变。已描述SERPINA1基因的一百种以上等位基因变体。变体总体上根据其对于血清AAT水平的效应来分类。举例来说，M等位基因是与正常血清AAT水平相关联的正常变体，而Z和S等位基因是与AAT水平减少相关联的突变型变体。Z和S等位基因的存在与α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD或A1AD)相关联，所述缺乏症是由SERPINA1基因中的导致产生异常AAT的突变来表征的遗传病症。存在许多形式和程度的AATD。“Z-变体”是最常见的AATD，其导致肝脏和肺部中的严重临床疾病。Z-变体的特征在于第5个外显子的5'末端中的单一核苷酸变化，结果在氨基酸位置342处的谷氨酸至赖氨酸的错义突变(E342K)。在Z等位基因处纯合(ZZ)和杂合(MZ或SZ)的患者中出现症状。存在一个或两个Z等位基因导致SERPINA1mRNA不稳定性，以及AAT蛋白质聚合和在肝脏细胞中的聚集。具有至少一种Z等位基因的患者由于聚集AAT蛋白在肝脏中的积累而具有增加的肝癌发病率。除了肝脏病变以外，由至少一种Z等位基因来表征的AATD还由肺病来表征，这是由于肺泡中的AAT减少和所导致的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制的减少。在北欧人群中，严重ZZ形式(即，Z变体的纯合表达)的发病率是1:2,000，并且在美国的发病率是1:4,500。另一种常见突变是S变体，其导致蛋白在分泌之前在细胞内被降级。与Z变体相比，S变体导致血清AAT的较轻微减少和肺病的较低风险。存在改善肝脏和肺部中的AATD的不利影响的需要。本公开提供在人类基因组基因座，诸如白蛋白安全港位点处表达异源AAT，从而允许分泌异源AAT和减轻肺部中的AATD的不利影响的组合物和方法。本公开还提供剔除内源性SERPINA1基因，从而消除患有AATD的患者中的与肝脏症状相关联的突变型AAT的产生的组合物和方法。本专利技术将剔除内源性SERPINA1等位基因与在安全港位点处插入异源AAT结合，以便恢复细胞或生物体中的AAT功能。具体地说，本文提供用于将编码AAT的核酸序列靶向插入人类安全港位点，诸如白蛋白安全港位点的内含子1中的指导RNA。还提供了包含编码AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)，其用于靶向插入人类安全港位点，诸如白蛋白安全港位点的内含子1。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA可与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和包含编码AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)组合使用。在一些实施方案中，供体构建体(例如，双向构建体)可与任何一个或多个基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统)一起使用。提供以下实施方案。在一些实施方案中，本公开提供将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群中的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群中。在一些实施方案中，本公开提供在有需要的受试者中表达AAT的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而在有需要的受试者中表达AAT。在一些实施方案中，本公开提供治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQIDNO:3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：/ni)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；/nii)RNA指导的DNA结合剂；以及/niii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：/na)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；/nb)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；/nc)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；/nd)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；/ne)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；/nf)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及/ng)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，/n从而将所述SERPINA1核酸引入所述细胞或细胞群。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181018 US 62/747,5221.一种将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而将所述SERPINA1核酸引入所述细胞或细胞群。


2.一种在有需要的受试者中表达AAT的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而在有需要的受试者中表达AAT。


3.一种治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而治疗所述受试者的AATD。


4.一种增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQIDNO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而增加从所述肝细胞或细胞群的AAT分泌。


5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述内源性SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)。


6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括修饰所述内源性SERPINA1基因。


7.如权利要求5或6所述的方法，其中在施用所述包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体、所述RNA指导的DNA结合剂和所述白蛋白gRNA之前或之后，在所述内源性SERPINA1基因内诱导所述DSB且/或对所述内源性SERPINA1基因进行修饰。


8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用SERPINA1指导RNA，所述RNA与存在于所述内源性人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中的靶序列至少部分互补。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述SERPINA1指导RNA包含选自SEQIDNO:1000-1128的指导序列或与选自SEQIDNO：1000-1128的序列的17、18、19、和/或20个连续核苷酸至少95％、90％、85％、80％或75％相同的指导序列。


10.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括与所述SERPINA1指导RNA一起施用RNA指导的DNA结合剂。


11.如权利要求8所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，非同源末端连接(NHEJ)导致突变。


12.如权利要求11所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入。


13.如权利要求12所述的方法，其中核苷酸的缺失或插入诱导所述内源性SERPINA1基因中的读框移位或无义突变。


14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述施用是在体外。


15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述施用是在体内。


16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述白蛋白gRNA包含指导序列，所述指导序列包括选自以下的序列：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。


17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述核酸构建体。


18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或白蛋白gRNA。


19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或SERPINA1gRNA。


20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述核酸载体为病毒载体。


21.如权利要求20所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。


22.如权利要求21所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10和其杂交体。


23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中以任何次序和/或以任何组合顺序施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1gRNA。


24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中单独或以任何组合同时施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1gRNA。


25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在施用所述核酸构建体之前施用所述RNA指导的DNA结合剂、或RNA指导的DNA结合剂和白蛋白gRNA的组合。


26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中在施用所述白蛋白gRNA和/或RNA指导的DNA结合剂之前施用所述核酸构建体。


27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂是2类Cas核酸酶。


28.如权利要求27所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。


29.如权利要求28所述的方法，其中所述Cas9核酸酶为酿脓链球菌Cas9核酸酶。


30.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为裂解酶。


31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为切口酶。


32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为双向核酸构建体。


33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链或双链的。


34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链DNA或双链DNA。


35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述双向构建体不包含驱动所述异源AAT蛋白表达的启动子。


36.如权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述受试者的功能性AAT水平增加到至少约500μg/ml。


37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中与施用之前的所述受试者的功能性AAT水平相比，所述受试者的功能性AAT水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。


38.如权利要求36或37所述的方法，其中测量在血清、血浆、血液、脑脊髓液和/或痰中的所述AAT水平。


39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中与施用之前的水平相比，所述细胞或细胞群表达功能性AAT的水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。


40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群能够表达AAT。


41.如权利要求40所述的方法，其中能够表达AAT的所述细胞或细胞群来源于肝脏、肺部、胃器官、肾、胃、近端和远端小肠、胰腺、肾上腺或大脑中的任何一种或多种的组织。


42.如权利要求4、5、8至37、或41中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群包括肝脏细胞(例如，肝细胞)或肺部细胞。


43.如权利要求42所述的方法，其中所述肝脏细胞为肝细胞。


44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述肝脏中的AAT积累得以减少。


45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码野生型AAT蛋白或其功能片段的序列。


46.一种在有需要的受试者中表达AAT的方法，其包括向所述受试者施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述受试者中表达AAT。


47.一种治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，其包括施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而治疗所述受试者的AATD。


48.一种在细胞或细胞群中表达AAT的方法，所述方法包括向所述细胞或细胞群施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述细胞或细胞群中表达AAT表达。


49.一种增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌的方法，其包括向所述细胞或细胞群施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而增加从所述肝细胞或细胞群的AAT分泌。


50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含异源AAT的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含所述异源AAT的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述异源AAT表达的启动子。


51.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含异源AAT的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含第二多肽的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述异源AAT和/或所述第二多肽表达的启动子。


52.如权利要求46至51中任一项所述的方法，其还包括施用RNA指导的DNA结合剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·芬恩，HR·黄，A·福尔热，X·解，
申请(专利权)人：英特利亚治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US