【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、随着最近发现和实施crispr/cas9编辑技术，在精确位置处修饰任何细胞的基因组的能力已得到提高。然而，在给定基因座处引入特异性定向变化的能力受到以下事实的阻碍：在cas9介导的dna裂解后发生的主要细胞修复途径为错误的非同源末端连接(nhej)途径。同源定向重组(hdr)相较于nhej效率较低，从而降低真核细胞中的编辑效率。
2、dna依赖性蛋白质激酶(dna-pk)是一种核丝氨酸/苏氨酸激酶，已显示其在dna双链断裂修复机制中是必需的。在哺乳动物中，双链dna断裂的主要修复途径是非同源末端连接(nhej)途径，其无关于细胞周期的阶段起作用并且通过去除双链断裂的不可接合末端并且接合末端来运作。dna-pk抑制剂(dna-pki)是一类结构多样的dna-pk和nhej途径的抑制剂。
3、对用于修饰基因组的高效系统和技术存在相当大的需求。还需要用模板核酸编辑核酸分子的高效方法。
技术实现思路
1、本公开涉及dna-pki以及其组合物和使用方法。
2、在某些实施方案中，所述dna-pki是具有式i结构的化合物：
3、
4、或其盐，
5、其中：
6、x1为c-r3或n；
7、r1为c1-c3烷基；
8、r2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个r6取代；
9、r3为h或c1-c3烷基；
10、r4为h或c1-c3烷基；>
11、r5为c1-c3烷基；
12、每个r6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
13、r7为h或c1-c3烷基，
14、条件是以下中的至少一者适用：
15、(a)x1为c-r3；
16、(b)r1为c2-c3烷基；
17、(c)r4为c1-c3烷基；
18、(d)r2被一个r6取代，并且r6为卤基；
19、(e)r2被两个r6取代，所述两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
20、(f)r2为任选地被一个或多个r6取代的c3-c5环烷基。
21、在优选实施方案中，本公开涉及选自以下的化合物：
22、
23、
24、或其盐。
25、在某些实施方案中，本公开涉及包含以下的dna-pki组合物：
26、a)dna蛋白质激酶抑制剂(dna-pki)；
27、b)dna切割剂；
28、c)任选地，细胞；和
29、d)任选地，供体dna；
30、其中所述dna-pki是式i化合物
31、
32、或其盐，
33、其中：
34、x1为c-r3或n；
35、r1为c1-c3烷基；
36、r2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个r6取代；
37、r3为h或c1-c3烷基；
38、r4为h或c1-c3烷基；
39、r5为c1-c3烷基；
40、每个r6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
41、r7为h或c1-c3烷基。
42、在某些实施方案中，本公开涉及一种用于在细胞中进行靶向基因组编辑的方法或一种在细胞基因组中修复双链dna断裂的方法或一种抑制或遏制经由非同源末端连接(nhej)途径修复细胞中的dna断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式i化合物
43、
44、或其盐，
45、其中：
46、x1为c-r3或n；
47、r1为c1-c3烷基；
48、r2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个r6取代；
49、r3为h或c1-c3烷基；
50、r4为h或c1-c3烷基；
51、r5为c1-c3烷基；
52、每个r6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
53、r7为h或c1-c3烷基。
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1.一种化合物，所述化合物具有式I结构：
2.如权利要求1所述的化合物，其中x1为C-R3。
3.如权利要求2所述的化合物，其中R3为H或甲基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中x1为N。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为C2-C3烷基。
6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R1选自甲基和乙基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中R1为甲基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4为C1-C3烷基。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中R4为H或甲基。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R4为H。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2为环烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中R2为C3-C7环烷基。
13.如权利要求12所述的化合物，其中R2为环己基。
14.如权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中R2为C3-C5环烷基。
15.如权利要
16.如权利要求15所述的化合物，其中R2为5元至7元杂环基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中R2为四氢吡喃基。
18.如权利要求16所述的化合物，其中R2为四氢呋喃基。
19.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤基和环烷基的R6取代，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
20.如权利要求19所述的化合物，其中R2被一个或多个R6取代；并且每个R6为卤基或羟基。
21.如权利要求20所述的化合物，其中R2被一个R6取代，并且R6为卤基。
22.如权利要求20或21所述的化合物，其中每个R6为氟。
23.如权利要求19所述的化合物，其中R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
24.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R5为甲基。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R7为H或甲基。
27.一种化合物，所述化合物选自：
28.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
29.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
30.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
31.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
32.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
33.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
34.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为
35.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为游离碱。
36.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为盐。
37.如权利要求36所述的化合物，其中所述盐包含三氟甲磺酸根阴离子。
38.一种组合物，所述组合物包含：
39.如权利要求38所述的组合物，其中x1为N。
40.如权利要求38或39所述的组合物，其中R1为甲基。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中R4为H。
42.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为环己基。
43.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为四氢吡喃基。
44.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为四氢呋喃基。
45.如权利要求38-44中任一项所述的组合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
46.如权利要求38-45中任一项所述的组合物，其中R5为甲基。
47.如权利要求38-46中任一项所述的组合物，其中R7为H或甲基。
48.如权利要求38所述的组合物，其中所述DNA-PKI为如权利要求1-37中任一项所述的化合物。
49.一种组合物，所述组合物包含：
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-P...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种化合物，所述化合物具有式i结构：
2.如权利要求1所述的化合物，其中x1为c-r3。
3.如权利要求2所述的化合物，其中r3为h或甲基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中x1为n。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r1为c2-c3烷基。
6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中r1选自甲基和乙基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中r1为甲基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r4为c1-c3烷基。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中r4为h或甲基。
10.如权利要求9所述的化合物，其中r4为h。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r2为环烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中r2为c3-c7环烷基。
13.如权利要求12所述的化合物，其中r2为环己基。
14.如权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中r2为c3-c5环烷基。
15.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中r2为杂环基。
16.如权利要求15所述的化合物，其中r2为5元至7元杂环基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中r2为四氢吡喃基。
18.如权利要求16所述的化合物，其中r2为四氢呋喃基。
19.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r2任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤基和环烷基的r6取代，或两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
20.如权利要求19所述的化合物，其中r2被一个或多个r6取代；并且每个r6为卤基或羟基。
21.如权利要求20所述的化合物，其中r2被一个r6取代，并且r6为卤基。
22.如权利要求20或21所述的化合物，其中每个r6为氟。
23.如权利要求19所述的化合物，其中r2被两个r6取代，所述两个r6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
24.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中r2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的r6取代。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r5为甲基。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中r7为h或甲基。
27.一种化合物，所述化合物选自：
28.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
29.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
30.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
31.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
32.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
33.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
34.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为
35.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为游离碱。
36.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为盐。
37.如权利要求36所述的化合物，其中所述盐包含三氟甲磺酸根阴离子。
38.一种组合物，所述组合物包含：
39.如权利要求38所述的组合物，其中x1为n。
40.如权利要求38或39所述的组合物，其中r1为甲基。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中r4为h。
42.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中r2为环己基。
43.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中r2为四氢吡喃基。
44.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中r2为四氢呋喃基。
45.如权利要求38-44中任一项所述的组合物，其中r2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的r6取代。
46.如权利要求38-45中任一项所述的组合物，其中r5为甲基。
47.如权利要求38-46中任一项所述的组合物，其中r7为h或甲基。
48.如权利要求38所述的组合物，其中所述dna-pki为如权利要求1-37中任一项所述的化合物。
49.一种组合物，所述组合物包含：
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
52.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
53.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
54.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
55.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
56.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
57.如权利要求49所述的组合物，其中所述dna-pki为或其盐。
58.如权利要求38-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的所述dna-pki的浓度为约1μm或更低。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述组合物中的所述dna-pki的浓度为约0.25μm或更低。
60.如权利要求38-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的所述dna-pki的浓度为约0.1-1μm。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述组合物中的所述dna-pki的浓度为约0.1-0.5μm。
62.如权利要求38-61中任一项所述的组合物，所述组合物包含细胞。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞为真核细胞。
64.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞为肝细胞。
65.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞可用于过继性细胞疗法(act)。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所述细胞可用于过继性细胞疗法。
67.如权利要求65或66所述的组合物，其中所述细胞为干细胞。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述干细胞为造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。
69.如权利要求65-68中任一项所述的组合物，其中所述细胞为免疫细胞。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述免疫细胞为白细胞或淋巴细胞。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述免疫细胞为淋巴细胞。
72.如权利要求71所述的组合物，其中所述淋巴细胞为t细胞、b细胞或nk细胞。
73.如权利要求71所述的组合物，其中所述淋巴细胞为t细胞。
74.如权利要求73所述的组合物，其中t细胞为原代t细胞。
75.如权利要求73所述的组合物，其中t细胞为调控t细胞。
76.如权利要求73-75中任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为活化t细胞。
77.如权利要求73-75中任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为非活化t细胞。
78.如权利要求62-77中任一项所述的组合物，其中所述细胞为人类细胞。
79.如权利要求38-78中任一项所述的组合物，其中所述dna切割剂包含crispr/cas核酸酶组分和任选地引导rna组分。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述dna切割剂选自锌指核酸酶、tale效应子域核酸酶(talen)、crispr/cas核酸酶组分和其组合。
81.如权利要求79所述的组合物，其中所述dna切割剂为crispr/cas核酸酶组分和引导rna组分。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述crispr/cas核酸酶组分包含cas核酸酶或编码所述cas核酸酶的mrna。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述crispr/cas核酸酶组分包含编码所述cas核酸酶的mrna。
84.如权利要求82或83所述的组合物，其中所述cas核酸酶为第2类cas核酸酶。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述cas核酸酶为cas9核酸酶。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述cas核酸酶为化脓性链球菌cas9核酸酶。
87.如权利要求85所述的组合物，其中所述cas核酸酶为脑膜炎双球菌cas9核酸酶。
88.如权利要求85所述的组合物，其中所述cas核酸酶为nme2cas9。
89.如权利要求81或82所述的组合物，其中所述cas核酸酶为cas12a核酸酶。
90.如权利要求38-89中任一项所述的组合物，所述组合物包含经修饰的rna。
91.如权利要求79-90中任一项所述的组合物，其中所述引导rna组分为引导rna核酸，例如引导rna。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述引导rna核酸为grna。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述引导rna核酸为双引导rna(dgrna)或编码双引导rna(dgrna)。
94.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述引导rna核酸为单引导(sgrna)或编码单引导(sgrna)。
95.如权利要求92-94中任一项所述的组合物，其中所述grna为经修饰的grna。
96.如权利要求95所述的组合物，其中所述经修饰的grna在5'端处包含在前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
97.如权利要求95或96所述的组合物，其中所述经修饰的grna在3'端处包含在最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
98.如权利要求38-97中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含引导rna核酸和第2类cas核酸酶mrna；并且所述mrna与所述引导rna核酸的比率按重量计为约2:1至1:4。
99.如权利要求38-98中任一项所述的组合物，所述组合物包含所述供体dna。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述供体dna包含模板，所述模板包含编码蛋白质的序列、调控序列或编码结构rna的序列。
101.如权利要求38-100中任一项所述的组合物，其中所述dna切割剂存在于脂质核酸组装组合物中。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物为脂质纳米颗粒(lnp)组合物。
103.如权利要求102所述的组合物，其中所述lnp的直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。
104.如权利要求102或103所述的组合物，其中所述组合物包含平均直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm的所述lnp的群体。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述平均直径为z平均直径。
106.如权利要求101所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物为脂质复合物。
107.如权利要求101-106中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述可离子化脂质的pka为约5.1至7.4，例如约5.5至6.6、约5.6至6.4、约5.8至6.2或约5.8至6.5。
109.如权利要求101-108中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含辅助脂质。
110.如权利要求101-109中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含中性脂质。
111.如权利要求101-110中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含peg脂质。
112.如权利要求101-111中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的n/p比为约3-10。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的所述n/p比为约5-7。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的所述n/p比为约6。
115.如权利要求38-114中任一项所述的组合物，所述组合物还包含载体。
116.如权利要求115所述的组合物，其中所述载体编码所述dna切割剂。
117.如权利要求115或116所述的组合物，其中所述载体编码所述供体dna。
118.如权利要求115-117中任一项所述的组合物，其中所述载体为病毒载体。
119.如权利要求115-117中任一项所述的组合物，其中所述载体为非病毒载体。
120.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为慢病毒载体。
121.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为逆转录病毒载体。
122.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为aav。
123.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞不为癌细胞。
124.一种在细胞中进行靶向基因组编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式i化合物
125.一种在细胞基因组中修复双链dna断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式i化合物
126.一种抑制或遏制经由非同源末端连接(nhej)途径修复细胞中的dna断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式i化合物
127.一种将供体dna靶向插入至细胞基因组中的方法，所述方法包括使所述细胞与dna切割剂、所述供体dna和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式i化合物
128.如权利要求124-127中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞在不含所述dna-pki的细胞培养基中生长，以及添加所述dna-pki至所述细胞培养基。
129.如权利要求124-128中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述dna-pki接触之前，使所述细胞与所述dn...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·梅塔尼，X·J·谢，A·福尔热，A·普罗德尤斯，S·亚辛斯基，R·G·帕尔马，
申请(专利权)人：英特利亚治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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