用于表达因子IX的组合物和方法技术

提供了用于在宿主细胞或宿主细胞群中表达因子IX的组合物和方法。还提供了表达因子IX的工程改造的宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表达因子IX的组合物和方法本申请要求2018年10月18日提交的美国临时申请号62/747,509、2019年4月3日提交的美国临时申请号62/829,009、2019年4月4日提交的美国临时申请号62/829,621和2019年4月29日提交的美国临时申请号62/840,352的优先权权益。上述申请中的每个的说明书以引用的方式整体并入本文。出血病症是由血液凝结不足引起的。此缺陷可能是由先天性凝血病症、获得性凝血病症或创伤诱导的流血病状引起的。出血是最严重且最显著的疾病表现中的一种，并且可能从局部位点发生或是全身性的。局部出血可能与病变相关，并且有缺陷的止血机制可能使其进一步复杂化。任何凝血因子的先天性或获得性缺陷都可能与流血倾向相关。出血病症的经典实例包括血友病，诸如由于因子VIII缺陷而引起的血友病A或由于因子IX缺陷而引起的血友病B(克雷司马斯病(ChristmasDisease))。血友病发生在所有种族和民族群体中，并且影响美国和全世界的许多人。用于出血病症的传统疗法包括肠胃外替换不足的凝血因子，诸如因子VII、因子VIII或因子IX。例如，用于血友病B的当前治疗依赖于长期反复静脉内输注纯化的重组因子IX。然而，这些治疗有许多缺点，包括需要反复静脉内输注、与抑制剂的形成相关以及通常更具预防性而不是治愈性。参见例如,Petrini2001,Hemophilia7:99；Fischer等人2002,Blood99(7):2337。涉及将缺失或缺陷的基因的拷贝引入患者体内的基因疗法提供了一种将因子IX引入到患者体内更长时间的可能方法。然而，需要提供因子IX的改善的长期表达的另外的组合物和方法。本公开提供可用于在宿主细胞或宿主细胞群中表达因子IX(体外或体内)以及用于治疗血友病(例如，血友病B)的组合物和方法。本文提供指导RNA，其用于将编码因子IX的序列靶向插入人基因组基因座，例如安全港位点，诸如白蛋白安全港位点。还提供了包含编码因子IX的序列的供体构建体(例如，双向构建体)，其用于靶向插入安全港位点，诸如白蛋白安全港位点的内含子1。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA可与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和包含因子IX转基因的供体构建体(例如，双向构建体)组合使用。在一些实施方案中，供体构建体(例如，双向构建体)可与基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统)一起使用。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA可与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和包含因子IX转基因的供体构建体(例如，双向构建体)组合使用。提供以下实施方案。在一些方面，本文提供一种将因子IX核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：i)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；以及iii)包含序列的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含序列，即选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含序列，即与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含序列，即选自由SEQIDNO:120-163组成的组的序列。在一些方面，本文提供一种在细胞或细胞群中表达因子IX的方法，所述方法包括施用：i)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；以及iii)包含序列的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:120-163组成的组的序列。在一些方面，本文提供一种在细胞或细胞群中引入或表达因子IX的方法，所述方法包括施用：i)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；以及iii)包含序列的指导RNA(gRNA)，其中施用是体外的。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA包含选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将因子IX核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：/ni)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；/nii)RNA指导的DNA结合剂；以及/niii)指导RNA(gRNA)，其包含选自以下的序列：/na)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；/nb)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；/nc)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；/nd)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；/ne)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；/nf)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；/ng)选自由SEQ ID NO:98-119组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；/nh)选自由SEQ ID NO:98-119组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；以及/ni)选自由SEQ ID NO:120-163组成的组的序列；以及/nj)选自由表2、表7和表8中的SEQ ID NO组成的组的序列，/n从而将所述因子IX核酸引入所述细胞或所述细胞群。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181018 US 62/747,509;20190403 US 62/829,009;20191.一种将因子IX核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：
i)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)指导RNA(gRNA)，其包含选自以下的序列：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；
g)选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
h)选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；以及
i)选自由SEQIDNO:120-163组成的组的序列；以及
j)选自由表2、表7和表8中的SEQIDNO组成的组的序列，
从而将所述因子IX核酸引入所述细胞或所述细胞群。


2.一种在细胞或细胞群中表达因子IX的方法，所述方法包括施用：
i)包含因子IX蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)指导RNA(gRNA)，其包含选自以下的序列：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列；
g)选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
h)选自由SEQIDNO:98-119组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；以及
i)选自由SEQIDNO:120-163组成的组的序列；
l)选自由表2、表7和表8中的SEQIDNO组成的组的序列，
从而在细胞或细胞群中表达因子IX。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述施用是体外的。


4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含指导序列，所述指导序列包括选自以下的序列：
a)与选自由SEQIDNo:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQIDNO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQIDNO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；以及
f)选自由SEQIDNO:34-97组成的组的序列。


5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述核酸构建体。


6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂为Cas9或编码Cas9的核酸。


7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂为编码所述RNA指导的DNA结合剂的核酸。


8.如权利要求7所述的方法，其中编码所述RNA指导的DNA结合剂的核酸为mRNA。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述mRNA为修饰的mRNA。


10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或gRNA。


11.如权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述核酸载体为病毒载体。


12.如权利要求11所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。


13.如权利要求12所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV-DJ和AAV2/8。


14.如权利要求13或14所述的方法，其中所述病毒载体为AAV载体。


15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中以任何顺序和/或以任何组合顺序施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂和gRNA。


16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中单独或以任何组合同时施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂和gRNA。


17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在施用所述核酸构建体之前施用所述RNA指导的DNA结合剂、或RNA指导的DNA结合剂和gRNA的组合。


18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在施用所述gRNA和/或RNA指导的DNA结合剂之前施用所述核酸构建体。


19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂为Cas核酸酶。


20.如权利要求19所述的方法，其中所述Cas核酸酶为2类Cas核酸酶。


21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9。


22.如权利要求21所述的方法，其中所述Cas核酸酶为酿脓链球菌Cas9核酸酶。


23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶具有位点特异性DNA结合活性。


24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为切口酶。


25.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为裂解酶。


26.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶不具有切口酶或裂解酶活性。


27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为双向核酸构建体。


28.如任何先前权利要求所述的方法，其中所述核酸构建体为同源非依赖性供体构建体。


29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链或双链的。


30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链DNA或双链DNA。


31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述双向构建体不包含驱动所述因子IX蛋白表达的启动子。


32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群表达具有异源信号肽的因子IX。


33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞或细胞群表达具有白蛋白信号肽的因子IX。


34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群表达具有因子IX信号肽的因子IX，任选地与异源肽组合。


35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群为肝脏细胞或包括肝脏细胞。


36.如权利要求35所述的方法，其中所述肝脏细胞为肝细胞。


37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述核酸编码野生型因子IX蛋白。


38.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述核酸编码突变型因子IX蛋白。


39.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸编码具有突变R338L的因子IX蛋白。


40.一种将因子IX核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括向所述细胞或细胞群施用包含因子IX蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述细胞或细胞群中表达因子IX。


41.一种在细胞或细胞群中表达因子IX的方法，所述方法包括向所述细胞或细胞群施用包含因子IX蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述细胞或细胞群中表达因子IX表达。


42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含因子IX的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含因子IX的编码序列的反向补体。
其中所述构建体不包含驱动因子IX表达的启动子。


43.如权利要求27至42中任一项所述的方法，其中所述双向核酸构建体在因子IX的编码序列上游包含剪接受体。


44.如权利要求40至43中任一项所述的方法，所述方法还包括施用RNA指导的DNA结合剂，例如作为编码RNA指导的DNA结合剂的核酸。


45.如权利要求40至44中任一项所述的方法，所述方法还包括施用gRNA。


46.如权利要求40至45中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述双向核酸构建体。


47.如权利要求40至46中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂。


48.如权利要求40至47中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述gRNA。


49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述核酸载体为病毒载体。


50.如权利要求49所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。


51.如权利要求50所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV-DJ和AAV2/8。


52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述病毒载体为AAV载体。


53.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中以任何顺序和/或以任何组合顺序施用所述双向核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂和gRNA。


54.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中以任何组合同时施用所述双向核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂和gRNA。


55.如权利要求40至53中任一项所述的方法，其中在施用所述双向核酸构建体之前施用所述RNA指导的DNA结合剂、或RNA指导的DNA结合剂和gRNA的组合。


56.如权利要求40至53中任一项所述的方法，其中在施用所述gRNA和/或RNA指导的DNA结合剂之前施用所述双向核酸构建体。


57.如权利要求40至56中任一项所述的方法，其中以任何组合在彼此的一小时内施用所述双向核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂和gRNA。


58.如权利要求40至57中任一项所述的方法，其中所述双向构建体不包含驱动所述因子IX蛋白表达的启动子。


59.如权利要求40至58中任一项所述的方法，其中所述双向构建体为单链或双链的。


60.如权利要求40至59中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链DNA或双链DNA。


61.如权利要求40至60中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸或与选自由SEQIDNO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列。


62.一种将因子IX核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·芬恩，HR·黄，M·罗伊，K·莱，R·萨特勒，C·克拉苏，C·王，
申请(专利权)人：英特利亚治疗股份有限公司，瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US