【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸构建体和使用方法本申请要求2018年10月18日提交的美国临时申请号62/747,393和2019年4月29日提交的美国临时申请号62/840,343的优先权权益。上述申请中的每个的说明书以引用的方式整体并入本文。基因治疗方法中的基因组编辑源于这样的观点：外源性引入缺失或以其他方式受损的遗传物质可纠正遗传疾病。长期以来，基因治疗因其在从业者如何处理和治疗人疾病方面的巨大潜力而被认可。不是依赖药物或手术，具有潜在遗传因素的患者可通过直接靶向潜在病因进行治疗。此外，通过靶向潜在的遗传病因，基因治疗可能有效治愈患者。但是，现有方法的临床应用仍需要在几个方面进行改进。本公开提供了双向核酸构建体，所述双向核酸构建体允许增强插入和表达例如编码治疗剂(诸如多肽)的感兴趣的核酸序列。如本文所述，双向构建体包含至少两个核酸区段，其中一个区段(第一区段)包含编码感兴趣的剂的编码序列(编码序列在本文中可称为“转基因”或第一转基因)，而另一区段(第二区段)包含其中序列的补体编码感兴趣的剂的序列(或第二转基因)。在一些实施方案中，构建体包含至少两个核酸区段，其中一个区段(第一区段)包含编码感兴趣的多肽的编码序列，而另一区段(第二区段)包含其中序列的补体编码感兴趣的多肽的序列。当与基因编辑系统组合使用时，核酸构建体的双向性允许构建体在靶插入位点内的任一方向上插入(不限于在一个方向上插入)，从而允许从以下中的任一个表达感兴趣的多肽：a)一个区段的编码序列，或2)另一(第二)区段的补体，从而增强插入和表达效率，如本文所例示。附图说明图1示出了如A...
【技术保护点】
1.一种双向核酸构建体，所述双向核酸构建体包含：/na)第一区段，所述第一区段包含诸如多肽的剂的编码序列；以及/nb)第二区段，所述第二区段包含剂的编码序列的反向补体，/n其中所述构建体不包含驱动诸如多肽的剂的表达的启动子。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181018 US 62/747,393;20190429 US 62/840,3431.一种双向核酸构建体，所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含诸如多肽的剂的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含剂的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动诸如多肽的剂的表达的启动子。
2.一种双向核酸构建体，所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含诸如第一多肽的第一剂的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含诸如第二多肽的第二剂的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述一种或多种剂的表达的启动子。
3.如权利要求1或2所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段在所述第一区段的3’。
4.如权利要求1至3中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段中反向补体的编码序列采用与所述第一区段的第一编码序列不同的密码子使用。
5.如权利要求1至4中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段包含核苷酸序列，其与所述第一区段中的编码序列具有至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％互补性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段的编码序列使用由所述第一区段中的编码序列所编码的一个或多个氨基酸的一个或多个替代密码子编码多肽。
7.如权利要求1至6中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段包含所述第一区段的编码序列或其片段的反向补体。
8.如权利要求7所述的双向核酸构建体，其中所述反向补体：
a.基本上不与所述第一区段的编码序列互补；
b.基本上不与所述第一区段的编码序列的片段互补；
c.与所述第一区段的编码序列高度互补；
d.与所述第一区段的编码序列的片段高度互补；
e.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少60％相同；
f.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少70％相同；
f.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少90％相同；
g.与所述第一区段的编码序列的反向补体50％至80％相同；且/或
h与所述第一区段的编码序列的反向补体60％至100％相同。
9.如权利要求1至8中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体不包含同源臂。
10.如权利要求1至9中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第一区段通过接头连接到所述第二区段。
11.如权利要求10所述的双向核酸构建体，其中所述接头的长度为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、500、1000、1500、2000个核苷酸。
12.如权利要求1至11中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第一区段和所述第二区段中的每个包含聚腺苷酸化序列，诸如聚腺苷酸化信号序列或聚腺苷酸化尾序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含剪接受体位点。
14.如权利要求13所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含所述第一区段的第一剪接受体位点5'和所述第二区段的第二剪接受体位点3'。
15.如权利要求1至14中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体为双链的，任选双链DNA。
16.如权利要求1至15中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体为单链的，任选单链DNA。
17.如权利要求1至16中任一项所述的双向核酸构建体，其中编码所述多肽的序列为密码子优化的。
18.如权利要求1至17中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含以下末端结构中的一个或多个：发夹、环、反向末端重复序列(ITR)或螺旋管。
19.如权利要求1至18中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含一个、两个或三个反向末端重复序列(ITR)。
20.如权利要求1至19中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含不多于两个ITR。
21.如权利要求1至20中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽为分泌型多肽。
22.如权利要求1至20中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽y为细胞内多肽。
23.如权利要求2至22中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不同的。
24.如权利要求1至23中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽为变体多肽。
25.如权利要求1至24中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽为肝脏蛋白。
26.如权利要求1至24中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽为非肝脏蛋白。
27.如权利要求1至26中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体为同源非依赖性构建体。
28.如权利要求1至27中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽在表达时包含异源信号肽。
29.如权利要求1至28中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述核酸编码异源信号肽。
30.如权利要求1至27中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述核酸不编码信号肽。
31.如权利要求1至27中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述多肽在表达时包含其自身的信号肽。
32.如权利要求1至31中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述核酸编码异源肽。
33.如权利要求32所述的双向核酸构建体，其中所述异源肽为2A。
34.一种载体，所述载体包含如权利要求1至33中任一项所述的构建体。
35.如权利要求34所述的载体，其中所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。
36.如权利要求34或35所述的载体，其中所述AAV包含单链基因组(ssAAV)或自互补基因组(scAAV)。
37.如权利要求34或35所述的载体，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、A...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·芬恩，HR·黄，
申请(专利权)人：英特利亚治疗股份有限公司，瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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