【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用脂质纳米粒子的体外MRNA递送方法本申请要求2017年9月29日提交的美国临时专利申请号62/566,232的优先权，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。将遗传变化引入干细胞(包括造血干细胞(HSC))及其后代中，对于基因编辑和基因治疗方法具有重要意义。干细胞(诸如HSC)在成熟细胞和定向祖细胞中失去增殖能力，使得它们对于基因编辑技术特别有用。举例而言，体外修饰HSC和干细胞的能力很重要，并且需要将生物剂递送至培养物中的HSC和其他干细胞的方法。特别需要用于递送培养物中的人类HSC的技术。HSC对于终身造血是必不可少的。HSC由于能够分化而产生所有髓系和淋巴系血液谱系的成熟后代或者能够自我更新而替代逐渐定向于分化的细胞，因此能够维持长期的功能性造血作用。HSC可用于恢复移植受者、免疫受损患者或其他患者体内的血液和免疫细胞。具体地，HSC的自体或同种异体移植可用于治疗患有遗传性免疫缺陷和自身免疫疾病以及多种造血病症的患者，以重建造血细胞谱系和免疫系统防御。将CRISPR/Cas基因编辑系统的组分递送至培养物中的HSC的方法是特别受关注的。本文提供将RNA(包括CRISPR/Cas系统组分)递送至包括HSC的造血细胞培养物的方法。所述方法将活性蛋白递送至体外培养的干细胞(包括HSC)，并且包括使所述细胞与提供编码所述蛋白质的mRNA的脂质纳米粒子(LNP)组合物接触。另外，提供在干细胞诸如HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化细胞的方法。在一些实施方案中，提供在HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化H...
【技术保护点】
1.一种将mRNA递送至造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)或HSPC群体的方法，所述方法包括：/na.将血清因子与包含所述mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；/nb.在体外使所述HSPC或所述HSPC群体与所述预孵育的LNP组合物接触；以及/nc.在体外培养所述HSPC或所述HSPC群体；/n从而将所述mRNA递送至所述HSPC或所述HSPC群体。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 US 62/566,2321.一种将mRNA递送至造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)或HSPC群体的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含所述mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述HSPC或所述HSPC群体与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.在体外培养所述HSPC或所述HSPC群体；
从而将所述mRNA递送至所述HSPC或所述HSPC群体。
2.一种将mRNA递送至HSPC的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含所述mRNA和胺脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.在体外培养所述HSPC；
从而将所述mRNA递送至所述HSPC。
3.一种将mRNA递送至干细胞或干细胞群体的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含所述mRNA的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述干细胞群体与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.在体外培养所述干细胞群体；
从而将所述mRNA递送至所述干细胞群体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述mRNA编码Cas核酸酶。
5.一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含所述Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述HSPC与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.培养所述HSPC；
从而将所述Cas核酸酶mRNA和所述gRNA引入所述HSPC。
6.一种在体外产生基因工程化的HSPC的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述HSPC与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.在体外培养所述HSPC；
从而产生基因工程化的HSPC。
7.一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入干细胞的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含所述Cas核酸酶mRNA、gRNA和胺脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述干细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.培养所述干细胞；
从而将所述Cas核酸酶mRNA和所述gRNA引入所述干细胞。
8.一种在体外产生基因工程化的干细胞诸如HSPC的方法，所述方法包括：
a.将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA和可生物降解脂质的LNP组合物一起预孵育；
b.在体外使所述细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及
c.在体外培养所述细胞；
从而产生基因工程化的干细胞，诸如HSPC。
9.如权利要求4所述的方法，其中所述LNP组合物还包含gRNA。
10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为2类Cas核酸酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述2类Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述Cas9核酸酶为酿脓链球菌Cas9。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述2类Cas核酸酶为Cpf1核酸酶。
14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述gRNA为双指导RNA(dgRNA)。
15.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述gRNA为单指导RNA(sgRNA)。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述接触步骤之后的洗涤步骤。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤时长在约1分钟与约72小时之间。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤时长在约1分钟与约24小时之间。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述接触步骤在约2小时与约24小时之间。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约4小时与约12小时之间。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约6小时与约12小时之间。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少60％。
23.如权利要求22所述的方法，其中其中转染后细胞存活率为至少70％。
24.如权利要求22所述的方法，其中其中转染后细胞存活率为至少80％。
25.如权利要求22所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少90％。
26.如权利要求22所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少95％。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述血清因子与所述LNP组合物一起预孵育约30秒至过夜。
28.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1分钟至1小时。
29.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1-30分钟。
30.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1-10分钟。
31.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约5分钟。
32.如权利要求27或权利要求31所述的方法，所述方法包括预孵育5分钟±2分钟。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约4℃下发生。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约25℃下发生。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约37℃下发生。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育步骤包括缓冲液。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述缓冲液包含HSPC培养基或由所述HSPC培养基组成。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述LNP组合物与血清一起预孵育。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述血清为哺乳动物、小鼠、灵长类动物或人类血清。
40.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中将所述LNP组合物与分离的血清因子一起预孵育。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述血清因子为ApoE。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述血清因子选自ApoE2、ApoE3和ApoE4。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述ApoE为重组人类蛋白。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养步骤包括在HSPC培养缓冲液中扩增所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述接触步骤与所述培养步骤之间更换所述培养基。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养步骤包括干细胞扩增剂。
47.如权利要求1-2、4-6或8-46中任一项所述的方法，其中所述HSPC为造血干细胞(HSC)。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体为人类细胞或样品。
49.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA和所述指导RNA核酸配制在单一LNP组合物中。
50.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA和所述gRNA共包...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·H·斯图尔特，M·P·瓦拉斯特，A·蒙蒂，P·K·纳伦德拉，Q·侯，
申请(专利权)人：英特利亚治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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