本发明专利技术公开了RPA特异性引物对、单链DNA、crRNA片段以及CRISPR‑Cas13a检测体系及其在制备ALV相关诊断产品和疫苗中的应用。本发明专利技术可以在37℃恒温条件下对目的核酸进行RPA扩增，对仪器设备要求低，扩增的目的片段转录为RNA后被特异性的crRNA识别，进而被Cas13a切割，Cas13a的“附带切割”活性可以切割体系中的RNA报告分子，本发明专利技术的RPA反应时间在30 min左右，SHERLOCK反应时间在40 min左右，总体的检测时间低于2 h；本发明专利技术配合侧流层析试纸条的应用将检测结果可视化能实现ALV‑A/B/J的快速检测和鉴别诊断。
【技术实现步骤摘要】
检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用。
技术介绍
禽白血病(avianleukosis，AL)是由反转录病毒科α肿瘤病毒属禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)除了引起禽肿瘤性疾病以外还可以导致鸡生长缓慢，免疫抑制，产蛋量减少等症状，给养禽业造成巨大的损失。按照ALV的宿主范畴、囊膜糖蛋白特性、病毒干扰实验和其它分子生物学特点，当前ALV被分为了11个亚群。其中A-D、J和K亚群为外源性ALV。C、D亚群在野外很少见，E-I亚群为内源性ALV，而F-I亚群主要感染野生禽类。外源性ALV中，A、B和J亚群对鸡有明显的致病性，对养禽业生产的危害也较大。E亚群是鸡体内普遍存在的内源性ALV，这个亚群的病毒虽然是低致病性的病毒，鸡群感染后基本无临床表现，却可以干扰临床诊断上对于外源性ALV的检测。禽反转录病毒基因组有共同的形式，由两条相同的单股、正链、线性RNA组成。单体长约7-11Kb，两分子的单体RNA在各自的5’端以氢键相连。ALV的基因结构为5′R-U5-gag-pol-env-U3-R-3′。其中gag基因编码p19、p12、p27和p15病毒核衣壳蛋白。p27蛋白是ALV的群特异性抗原有很多易于检测的表位，临床上多数试剂盒主要通过检测p27蛋白来确诊ALV。pol基因编码逆转录酶和整合酶，逆转录酶将病毒从RNA反转录为DNA，整合酶负责将前病毒DNA整合至宿主细胞染色体内。gap和pol这两种基因在ALV各亚群中序列高度保守且同源性高。gp85和gp37两种囊膜糖蛋白由env基因编码。gp85蛋白能识别宿主细胞膜上的特异性病毒受体，决定ALV的亚群特异性及中和活性。目前市场上暂无预防和治疗ALV的疫苗和药物，所以只能通过检测并淘汰所有ALV为阳性的鸡进行防控。国内外已经建立了多种ALV的检测方法，包括病毒分离、ELISA、IFA、免疫组织化学和PCR等，这些检测技术都有其适用性。但是都有检测流程繁琐且不方便，检测时间较长的缺点，最短的方法也需要半天时间才能得出结论，病毒分离更是长达1周，需要的设备较多，且检测人员需要有一定的技术支持和分子生物学知识。因此适合于田间应用的快速检测方法，对ALV的净化和防控有重要意义。有规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中，其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的tracRNA(trans-activatingCRISPRRNA)共同构成引导RNA(guideRNA，gRNA)，gRNA可引导核酸内切酶Cas蛋白(CRISPRassociatedprotein)对噬菌体的基因片段进行切割，构成细菌的适应性免疫系统，但不存在于真核生物或病毒中。目前CRISPR/Cas系统分为2类，VI型和30多种亚型。在Cas蛋白和CRISPRRNA(crRNA)形成效应复合物时，1类系统(包括I型，III型和IV型)需要多个Cas蛋白，而2类系统(包括II型，V型和VI型)只需单个多结构域的Cas蛋白。Cas13属于2类CRISPR系统的VI型，只切割单链而不切割双链RNA，该系统可分为A～D4种亚型。Cas13效应蛋白在识别靶RNA上的前间区序列侧翼位点(Protospacerflankingsite，PFS)并与其结合的过程中可发生构象变化，导致由HEPN1和HEPN2结构域组成的催化位点活化。活化的Cas13a的HEPN催化位点位于蛋白质外表面，表现出HEPN-RNase活性，导致靶RNA在结合区域的外部被切割，并在切割完成后仍保持活性，继续切割其他非靶标RNA，即具有“附带切割”能力。2017年，张峰等开发了特异性高灵敏度酶解报告基因解锁(specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking，SHERLOCK)检测系统。在该系统中，目标模板首先经重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)(用于检测DNA靶标)或逆转录RPA(用于检测RNA靶标)为含有T7启动子的DNA模板，后经T7RNA聚合酶逆转录，产物可作为Cas13a切割的靶标，在Cas13a对上述靶标特异性切割后激活“附带切割”功能，切割体系中单链RNA荧光报告探针能产生可被检测的荧光信号。相比先前的研究，PRA方法的引入显著提高了该方法的检测灵敏度。多个课题组进一步拓展了Cas13a在不同分子检测领域的实际应用。当前相关研究已经报道了CRISPR/Cas13a检测体系被用于寨卡病毒、登革热病毒、EB病毒、H7N9禽流感病毒、埃博拉病毒、致病细菌株及其耐药基因和SNP分型等多种靶标检测。基于CRISPR/Cas13a的方法在1-2h内便可肉眼观测病原体的检测及分型结果，结合其高灵敏度，使用SHERLOCK可快速检测病毒核酸，特别是在野外和欠缺医疗设备的地区。其快速、价廉、准确的特点非常适用于临床应用。任何一项检测技术都不是完美的，CRISPR/Cas13a体系也不例外。基于Casl3a的检测需使用RNA荧光报告基团，其易受环境中RNA酶降解，可能出现假阳性结果。此外，单独使用Cas检测的灵敏度偏低，现有CRISPR检测方法均需扩增相应目标核酸以提高检测灵敏度。当前应用RPA来进行目标核酸的s4预扩增，其关键就是引物的设计。但RPA没有专用的设计软件，只能根据相关产品的说明书和指导手册来设计几对引物进行实验，筛选出能扩增出目的序列的引物。RPA引物的错配容忍性特别高，据相关文献报道在引物错配达到9个时仍可以扩增出序列。因此仅用RPA引物扩增出来的可能不是能进行鉴别诊断的目的片段。然而，CRISPR/Cas13a中的crRNA有高度的错配敏感性，仅能容忍一个碱基的错配，能对序列高度同源的病毒株进行区分，特别适合像ALV这种多亚群毒株的鉴别诊断。目前报道的CRISPR检测方法尚处于实验室开发阶段，在临床工作中的实际作用如何尚需进一步评估，以确保其具有良好的临床适用性。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术针对上述已有的ALV检测技术和方法存在操作繁杂、仪器设备昂贵、技术要求高、耗时长且不适于田间检测的缺点，提供了用于诊断ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段、CRISPR-Cas13a检s5测体系以及基于CRISPR-Cas13a的检测ALV-A/B/J的相关诊断产品和疫苗等，其具有很高的特异性和敏感性，能为ALV-A/B/J感染的诊断提供一个快速、简便、准确的检测方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了RPA特异性引物对，所述RPA特异性引物对选自如下一种或多种组合：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.RPA特异性引物对，其特征在于，所述RPA特异性引物对选自如下一种或多种组合：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物对；或SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物对；或SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物对。/n
【技术特征摘要】
1.RPA特异性引物对，其特征在于，所述RPA特异性引物对选自如下一种或多种组合：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对；或SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对；或SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物对。
2.一种单链DNA，其特征在于，所述单链DNA包含了权利要求1所述的RPA特异性引物对扩增后片段的部分碱基，所述单链DNA核苷酸序列分别如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示。
3.根据权利要求2所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA还包括T7启动子序列与LwCas13a蛋白结合的锚定序列。
4.根据权利要求2所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA的基因核苷酸序列如SEQIDNO.10或SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示。
5.crRNA片段，其特征在于，所述crRNA片段的序列如SEQIDNO.13或SEQIDNO.14或SEQIDNO.15所示。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晴晴，姚永秀，维诺·奈尔，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，英国佩布赖特动物健康研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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