阿洛酮糖的无细胞生产制造技术

在一些实施方案中，本文提供用于通过使用酶如热稳定性酶将多糖转化为阿洛酮糖的无细胞系统、方法、试剂盒和组合物(例如，细胞和细胞裂解物)。胞裂解物)。胞裂解物)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】阿洛酮糖的无细胞生产
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2018年12月21日提交的美国临时申请号62/784,314的权益，其通过引用完整并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]用于将多糖转化为单糖的现有技术采用多种生物转化，在每个步骤之后具有广泛的纯化过程。虽然这些过程相对便宜，但由于应用固定化酶和连续生产系统，下游加工显著影响成本。
[0005]专利技术概述
[0006]本文提供了用于将多糖酶促转化为阿洛酮糖的无细胞系统、方法、组合物和试剂盒。本公开的方法和系统在无细胞反应(例如，一罐(one
‑
pot)(由多个裂解物组成)无细胞反应系统)中实施糖生产途径，以将多糖(例如，麦芽糖糊精)转化为阿洛酮糖。与通常涉及将底物(例如葡萄糖)磷酸化为葡萄糖6
‑
磷酸并使用高能磷酸盐源(如ATP和磷酸烯酰丙酮酸)的方法不同，本文所述的方法通常用例如廉价的无机磷酸盐(P
i
)代替高能磷酸盐源。使用α
‑
葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸，然后，通过葡糖磷酸变位酶将所述葡萄糖1
‑
磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸。任选地，可以使用脱支酶(异淀粉酶或支链淀粉酶)通过分支键断裂来分解多糖，从而增加葡聚糖磷酸化酶的底物可用性。葡糖磷酸异构酶的后续酶促反应产生果糖6
‑
磷酸，然后通过阿洛酮糖6
‑
磷酸3
‑
差向异构酶(本文也称为阿洛酮糖6
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磷酸差向异构酶、果糖6
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磷酸3
‑
差向异构酶或果糖6
‑
磷酸差向异构酶)将果糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖6
‑
磷酸。最后，使用阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶创建最终产物阿洛酮糖(图1)。碳水化合物质量从淀粉衍生的多糖中的高能状态转移到低能单糖阿洛酮糖。因此，反应热力学——底物磷酸化到产物去磷酸化——有利于产物。
[0007]此外，由于途径的最后一步，在通过特定的阿洛酮糖
‑
6磷酸酶将阿洛酮糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖的过程中，本文所述的酶促过程作为整体基本上是不可逆的，从而允许期望的阿洛酮糖的高产率。相比之下，例如，将多糖转化为阿洛酮糖的典型生物转化方法采用三个不同的过程，其中两个是可逆的，产物的终浓度由所用酶的热力学控制。例如，将淀粉转化为葡萄糖，将葡萄糖异构化为果糖，将果糖差向异构化为阿洛酮糖。葡萄糖异构化为果糖的产率为约45％，因此需要大量的下游加工产生纯产物并回收未催化的底物。类似地，果糖差向异构化为阿洛酮糖的产率为约20％，同样需要类似的大量下游加工。在如本文所述的无细胞系统中将多糖直接转化为阿洛酮糖的能力通过减少下游加工和底物损失来降低成本。
[0008]可用于本文提供的方法中的许多酶是热稳定性，其(1)实现进行转化过程的细胞裂解物内含有的有害活性的热失活，以及(2)降低微生物污染物对生产运行产生负面影响的机会。这些转化途径的酶可以从嗜热的、嗜温的或嗜冷的生物体中分离，和/或在一些实施方案中，可以经工程化改造以增加(或降低)酶的热稳定性或特异性。嗜热性生物体(嗜热生物)在41℃至122℃(106
°
F至252
°
F)之间的高温充分生长。嗜温性生物体(嗜温生物)在20℃至45℃(68
°
F至113
°
F)之间的中等温度充分生长。嗜冷性生物体(嗜冷生物)在
‑
20℃至10
℃(
‑4°
F至50
°
F)的低温充分生长。
[0009]因此，本公开的一些方面提供了如下生产阿洛酮糖的无细胞方法，即使用α
‑
葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸，使用葡糖磷酸变位酶将葡萄糖1
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磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸，使用葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
‑
磷酸，使用阿洛酮糖6
‑
磷酸差向异构酶将果糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖6
‑
磷酸，最后使用阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖(见图1)。
[0010]因此，本公开的一些方面提供了如下生产阿洛酮糖的无细胞方法，即使用纤维糊精磷酸化酶将纤维素/纤维糊精转化为葡萄糖1
‑
磷酸，使用葡糖磷酸变位酶将葡萄糖1
‑
磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸，使用葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
‑
磷酸，使用阿洛酮糖
‑
6磷酸差向异构酶将果糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖6
‑
磷酸，最后使用阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖(见图2)。
[0011]本公开的一些方面提供了一种从多糖生产葡萄糖1
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磷酸的无细胞方法，所述方法包括使用α
‑
葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸，所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：AaGlgp(源自风产液菌(Aquifex aeolicus))、TzAgp(源自齐利格热球菌(Thermococcus zilligii))、PtAgp(源自温泉假热袍菌(Pseudothermotoga thermarum))、Tm08495(源自海栖热袍菌(Thermotoga Maritima))、TcGlgP(源自嗜热栖热菌(Thermus caldophilus))和PfAgp(源自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))。在一些实施方案中，本公开提供了一种生产阿洛酮糖的方法，包括使用α
‑
葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸，所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：AaGlgp(源自风产液菌)、TzAgp(源自齐利格热球菌)、PtAgp(源自温泉假热袍菌)、Tm08495(源自海栖热袍菌)、TcGlgP(源自嗜热栖热菌)和PfAgp(源自激烈火球菌)。如本领域技术人员将理解的，从多糖到阿洛酮糖的方法中的其他步骤可由如本文或本领域中描述的其他酶进行。
[0012]本公开的一些实施方案提供了一种从葡萄糖6
‑
磷酸生产果糖6
‑
磷酸的无细胞方法，所述方法包括使用葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
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磷酸，所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌(Clost本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从多糖生产葡萄糖1
‑
磷酸的无细胞方法，所述方法包括：使用选自下组的α
‑
葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸：AaGlgp(源自风产液菌)、TzAgp(源自齐利格热球菌)、PtAgp(源自温泉假热袍菌)、Tm08495(源自海栖热袍菌)、TcGlgP(源自嗜热栖热菌)和PfAgp(源自激烈火球菌)。2.权利要求1的方法，其中所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：TzAgp(源自齐利格热球菌)和PfAgp(源自激烈火球菌)。3.权利要求1的方法，其中所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：AaGlgp(源自风产液菌)、TzAgp(源自齐利格热球菌)和PtAgp(源自温泉假热袍菌)。4.权利要求1的方法，其中将所述多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸还包括使用脱支酶。5.权利要求4的方法，其中所述脱支酶是支链淀粉酶、异淀粉酶或其组合。6.权利要求5的方法，其中所述支链淀粉酶选自下组：Fp1793(源自Fervidobacterium pennavorans)、BfPull(源自黄热芽孢杆菌)和TRQ5Pul(源自栖热袍菌属种RQ5)。7.权利要求5的方法，其中所述异淀粉酶选自下组：StTreX(源自东工大硫化叶菌)、MhTreX(源自箱根生金球形菌)和StGlgX(源自嗜热球形杆菌)。8.权利要求5的方法，其中所述异淀粉酶是StTreX(源自东工大硫化叶菌)。9.权利要求1的方法，其还包括：使用葡糖磷酸变位酶将葡萄糖1
‑
磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸。10.权利要求9的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)、Af0458(源自闪烁古球菌)、CtPgm2(源自热纤梭菌)、TtPgm2(源自嗜热栖热菌)和TiManB(源自岛栖热菌)。11.权利要求9的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)和CtPgm2(源自热纤梭菌)。12.权利要求9的方法，其还包括：使用葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
‑
磷酸。13.权利要求12的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)、MjPgi(源自詹氏甲烷球菌)、PfPgi(源自激烈热球菌)、Ap0768(源自敏捷气火菌)和Cl1150(源自Caldisphaera lagunensis)。14.权利要求12的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：PfPgi(源自激烈火球菌)、Ap0768(源自敏捷气火菌)和Cl1150(源自Caldisphaera lagunensis)。15.权利要求12的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)和PfPgi(源自激烈火球菌)。16.权利要求12的方法，其还包括：使用阿洛酮糖6
‑
磷酸差向异构酶将果糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖6
‑
磷酸。17.权利要求16的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸差向异构酶选自下组：BtAlsE(源自热红短芽孢杆菌)、Thebr1340(源自布氏嗜热厌氧杆菌)、CasuRpe2(源自地下嗜热厌氧菌)、Defds2125(源自于脱硫铁还原杆菌)、Hg1285(源自Hydrogenivirga种128
‑5‑
R1
‑
1)、Tthe1731(源自热解糖热厌氧杆菌)、Theru00510(源自红色热发状菌)、That0313(源自大西洋栖热腔菌)和ThtaRpe(源自高井热硫化物杆菌)。18.权利要求16的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸差向异构酶选自下组：BtAlsE(源自
热红短芽孢杆菌)、Hg1285(源自Hydrogenivirga种128
‑5‑
R1
‑
1)和Tthe1731(源自热解糖热厌氧杆菌)。19.权利要求16的方法，其还包括：使用阿洛酮糖6
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磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6
‑
磷酸转化为阿洛酮糖。20.权利要求19的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶选自下组：AaGph(源自风产液菌)、Acel0099(源自解纤维酸热菌)、CsPpaX(源自地下嗜热厌氧菌)、Cthe0261(源自热纤梭菌)、Desku1269(源自库氏脱硫肠状菌)、Dgeo0096(源自地热异常球菌DSM 11300)、Mth1760(源自热自养甲烷热杆菌)、Pho459(源自掘越氏焦球菌Ot3)，Pmob0141(源自移动石袍菌)、Tagg0346(源自聚集热球形菌)、Tfu0224(源自褐色嗜热裂孢菌)、Theet2005(源自产乙醇热厌氧杆菌)、Thein1775(源自印度热脱硫杆菌)、TheisHAD(源自岛栖热菌)、Thewi1735(源自威吉利热厌氧杆菌)、TtC1471(源自嗜热栖热菌)、Vdis0326(源自古细菌泉古菌13_1_40CM_3_53_5)、Bf9343(源自脆弱拟杆菌)、Bvu4110(源自普通拟杆菌)和Ctn1320(源自新阿波罗栖热袍菌)。21.权利要求19的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶选自下组：Cthe0261(源自热纤梭菌)、Bf9343(源自脆弱拟杆菌)和Bvu4110(源自普通拟杆菌)。22.权利要求1的方法，其中所述多糖是麦芽糖糊精、淀粉、糖原、纤维素或纤维糊精。23.一种从葡萄糖6
‑
磷酸生产果糖6
‑
磷酸的无细胞方法，所述方法包括：使用选自下组的葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
‑
磷酸：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)、MjPgi(源自詹氏甲烷球菌)、PfPgi(源自激烈火球菌)、Ap0768(源自敏捷气火菌)和Cl1150(源自Caldisphaera lagunensis)。24.权利要求23的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：PfPgi(源自激烈火球菌)、Ap0768(源自敏捷气火菌)和Cl1150(源自Caldisphaera lagunensis)。25.权利要求23的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)和PfPgi(源自激烈火球菌)。26.权利要求23的方法，其还包括：使用葡糖磷酸变位酶将葡萄糖1
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磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸。27.权利要求26的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)、Af0458(源自闪烁古球菌)、CtPgm2(源自热纤梭菌)、TtPgm2(源自嗜热栖热菌)和TiManB(源自岛栖热菌)。28.权利要求26的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)和CtPgm2(源自热纤梭菌)。29.权利要求26的方法，其还包括：使用α
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葡聚糖磷酸化酶将所述多糖转化为葡萄糖1
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磷酸。30.权利要求29的方法，其中所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：Tm08495(源自海栖热袍菌)、AaGlgP(源自风产液菌)、TcGlgP(源自嗜热栖热菌)、PtAgp(源自温泉假热袍菌)、TzAgp(源自齐利格热球菌)和PfAgp(源自激烈火球菌)。31.权利要求29的方法，其中所述α
‑
葡聚糖磷酸化酶选自下组：TzAgp(源自齐利格热球菌)和PfAgp(源自激烈热球菌)。32.权利要求29的方法，其中所述α
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葡聚糖磷酸化酶选自下组：TzAgp(源自齐利格热球
菌)、PtAgp(源自温泉假热袍菌)和AaGlgP(源自风产液菌)。33.权利要求29的方法，其中将多糖转化为葡萄糖1
‑
磷酸的步骤还包括使用脱支酶。34.权利要求33的方法，其中所述脱支酶是支链淀粉酶、异淀粉酶或其组合。35.权利要求34的方法，其中所述支链淀粉酶选自下组：Fp1793(源自Fervidobacterium pennavorans)、BfPull(源自黄热芽孢杆菌)和TRQ5Pul(源自栖热袍菌属种RQ5)。36.权利要求34的方法，其中所述异淀粉酶选自下组：StTreX(源自东工大硫化叶菌)、MhTreX(源自箱根生金球形菌)和StGlgX(源自嗜热球形杆菌)。37.权利要求34的方法，其中所述异淀粉酶是StTreX(源自东工大硫化叶菌)。38.权利要求29的方法，其中所述多糖是麦芽糖糊精、淀粉、糖原、纤维素或纤维糊精。39.权利要求23的方法，其还包括：使用阿洛酮糖
‑
6磷酸差向异构酶将果糖6
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磷酸转化为阿洛酮糖6
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磷酸。40.权利要求39的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸差向异构酶选自下组：BtAlsE(源自热红短芽孢杆菌)、Thebr1340(源自布氏嗜热厌氧杆菌)、CasuRpe2(源自地下嗜热厌氧菌)、Defds2125(源自于脱硫铁还原杆菌)、Hg1285(源自Hydrogenivirga种128
‑5‑
R1
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1)、Tthe1731(源自热解糖热厌氧杆菌)、Theru00510(源自红色热发状菌)、That0313(源自大西洋栖热腔菌)和ThtaRpe(源自高井热硫化物杆菌)。41.权利要求39的方法，其中所述阿洛酮糖6
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磷酸差向异构酶选自下组：BtAlsE(源自热红短芽孢杆菌)、Hg1285(源自Hydrogenivirga种128
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R1
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1)和Tthe1731(源自热解糖热厌氧杆菌)。42.权利要求39的方法，其还包括：使用阿洛酮糖6
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磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6
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磷酸转化为阿洛酮糖。43.权利要求42的方法，其中所述阿洛酮糖6
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磷酸磷酸酶选自下组：AaGph(源自风产液菌)、Acel0099(源自解纤维酸热菌)、CsPpaX(源自地下嗜热厌氧菌)、Cthe0261(源自热纤梭菌)、Desku1269(源自库氏脱硫肠状菌)、Dgeo0096(源自地热异常球菌DSM 11300)、Mth1760(源自热自养甲烷热杆菌)、Pho459(源自掘越氏焦球菌Ot3)，Pmob0141(源自移动石袍菌)、Tagg0346(源自聚集热球形菌)、Tfu0224(源自褐色嗜热裂孢菌)、Theet2005(源自产乙醇热厌氧杆菌)、Thein1775(源自印度热脱硫杆菌)、TheisHAD(源自岛栖热菌)、Thewi1735(源自威吉利热厌氧杆菌)、TtC1471(源自嗜热栖热菌)、Vdis0326(源自古细菌泉古菌13_1_40CM_3_53_5)、Ctn1320(源自新阿波罗栖热袍菌)、Bf9343(源自脆弱拟杆菌)和Bvu4110(源自普通拟杆菌)。44.权利要求42的方法，其中所述阿洛酮糖6
‑
磷酸磷酸酶选自下组：Cthe0261(源自热纤梭菌)、Bf9343(源自脆弱拟杆菌)和Bvu4110(源自普通拟杆菌)。45.一种从多糖生产阿洛酮糖的无细胞方法，所述方法包括：使用α
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葡聚糖磷酸化酶将多糖转化为葡萄糖1
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磷酸；使用葡糖磷酸变位酶将葡萄糖1
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磷酸转化为葡萄糖6
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磷酸；使用葡糖磷酸异构酶将葡萄糖6
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磷酸转化为果糖6
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磷酸；使用阿洛酮糖
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6磷酸差向异构酶将果糖6
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磷酸转化为阿洛酮糖6
‑
磷酸；和使用阿洛酮糖
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6磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6
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磷酸转化为阿洛酮糖。
46.权利要求45的方法，其中所述α
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葡聚糖磷酸化酶选自下组：Tm08495(源自海栖热袍菌)、AaGlgP(源自风产液菌)、TcGlgP(源自嗜热栖热菌)、PtAgp(源自温泉假热袍菌)、TzAgp(源自齐利格热球菌)和PfAgp(源自激烈火球菌)。47.权利要求45或46中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)、Af0458(源自闪烁古球菌)、CtPgm2(源自热纤梭菌)、TtPgm2(源自嗜热栖热菌)和TiManB(源自岛栖热菌)。48.权利要求45
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47中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)、MjPgi(源自詹氏甲烷球菌)、PfPgi(源自激烈火球菌)、Ap0768(源自敏捷气火菌)和Cl1150(源自Caldisphaera lagunensis)。49.权利要求45
‑
48中任一项的方法，其中所述阿洛酮糖6
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磷酸差向异构酶选自下组：BtAlsE(源自热红短芽孢杆菌)、Thebr1340(源自布氏嗜热厌氧杆菌)、CasuRpe2(源自于地下嗜热厌氧菌)、Defds2125(源自脱硫脱铁杆菌)、Hg1285(源自Hydrogenivirga种128
‑5‑
R1
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1)、Tthe1731(源自热解糖热厌氧杆菌)、Theru00510(源自红色热发状菌)、That0313(源自大西洋栖热腔菌)和ThtaRpe(源自高井热硫化物杆菌)。50.权利要求45
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49中任一项的方法，其中所述阿洛酮糖6
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磷酸磷酸酶选自下组：Bf9343(源自脆弱拟杆菌)、Bvu4110(源自普通拟杆菌)、AaGph(源自风产液菌)、Acel0099(源自解纤维酸热菌)、CsPpaX(源自地下嗜热厌氧菌)、Cthe0261(源自热纤梭菌)、Desku1269(源自库氏脱硫肠状菌)、Dgeo0096(源自地热异常球菌DSM 11300)、Mth1760(源自热自养甲烷热杆菌)、Pho459(源自掘越氏焦球菌Ot3)，Pmob0141(源自移动石袍菌)、Tagg0346(源自聚集热球形菌)、Tfu0224(源自褐色嗜热裂孢菌)、Theet2005(源自产乙醇热厌氧杆菌)、Thein1775(源自印度热脱硫杆菌)、TheisHAD(源自岛栖热菌)、Thewi1735(源自威吉利热厌氧杆菌)、TtC1471(源自嗜热栖热菌)、Vdis0326(源自古细菌泉古菌13_1_40CM_3_53_5)和Ctn1320(源自新阿波罗栖热袍菌)。51.权利要求45
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50中任一项的方法，其中所述α
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葡聚糖磷酸化酶选自下组：TzAgp(源自齐利格热球菌)、AaGlgP(源自风产液菌)和PtAgp(源自温泉假热袍菌)。52.权利要求45
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51中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸变位酶选自下组：Tk1621(源自小宝岛热球菌)、Pk02350(源自Pyrococcus kukulkanii)和CtPgm2(源自热纤梭菌)。53.权利要求45
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52中任一项的方法，其中所述葡糖磷酸异构酶选自下组：CtPgi(源自热纤梭菌)、TtPgi(源自嗜热栖热菌)和PfPgi(源自激烈...

【专利技术属性】
技术研发人员：D马塞克兰，DS坎宁翰，WJ布莱克，ME穆拉，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：