γ-谷氨酰激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了γ‑谷氨酰激酶突变体及其应用。本发明专利技术提供了γ‑谷氨酰激酶突变体蛋白，为如下A或B：A）所述的蛋白为将γ‑谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ‑谷氨酰激酶活性的蛋白；B）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ‑谷氨酰激酶活性的由A衍生的蛋白。本发明专利技术提供了γ‑谷氨酰激酶（ProB）突变体蛋白，将含有该蛋白的谷氨酸棒杆菌进行发酵，解除L‑脯氨酸反馈抑制，提高了脯氨酸的产量。

【技术实现步骤摘要】
γ-谷氨酰激酶突变体及其应用
本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及γ-谷氨酰激酶突变体及其应用，以及利用该突变体生产脯氨酸及其衍生物的方法。
技术介绍
脯氨酸（通常所说的脯氨酸为L-脯氨酸），是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。脯氨酸的生产方法主要有化学法和发酵法，由于化学提取法污染严重成本高，已逐渐失去市场，微生物发酵法由于具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业应用最广泛的方法。目前，常用的工业发酵菌株有棒杆菌和埃希氏菌，常用的埃希氏菌如大肠杆菌（Escherichiacoli），常用的棒杆菌如谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum），短杆菌如黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）、乳酸发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentus），以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。而由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株用来生产氨基酸等产品。在棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ-谷氨酰激酶（ProB）、谷氨酸半醛脱氢酶（ProA）和吡咯啉-5-羧酸还原酶（ProC）催化后生产L-脯氨酸。γ-谷氨酰激酶（ProB）作为其中最关键的酶，其活性受到产物L-脯氨酸的反馈抑制。因此，如何筛选获得解除L-脯氨酸反馈抑制的γ-谷氨酰激酶，对于选育L-脯氨酸的高产菌株具有重要意义。因此，迫切需要寻找新的谷氨酸棒杆菌来源的ProB突变体。专利
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供新的来源于谷氨酸棒杆菌的解除L-脯氨酸反馈抑制的γ-谷氨酰激酶突变体蛋白。本专利技术提供的γ-谷氨酰激酶（ProB）突变体蛋白，为如下A或B：A）所述的蛋白为将γ-谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ-谷氨酰激酶活性的蛋白；B）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ-谷氨酰激酶活性的由A）衍生的蛋白。上述蛋白中，所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）、谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）、脯氨酸（P）、精氨酸（R）、谷氨酸（E）、丙氨酸（A）、酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、半胱氨酸（C）、色氨酸（W）和蛋氨酸（M）中任一种；优选为将对应于序列1的第150位氨基酸残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、组氨酸（H）、酪氨酸（Y）中的任一个；更优选为将对应于序列1的第150位氨基酸残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）。本专利技术另一个目的是提供一种具有γ-谷氨酰激酶活性的组合物。本专利技术提供的具有γ-谷氨酰激酶活性的组合物，其包括含有上述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的蛋白组合物或含有上述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的融合蛋白。编码上述突变体蛋白的多核苷酸或编码上述融合蛋白的多核苷酸也是本专利技术保护的范围。含有编码上述蛋白的多核苷酸的表达盒或重组载体或重组微生物也是本专利技术保护的范围。上述重组微生物为含有编码上述蛋白的多核苷酸的宿主菌，该宿主菌包括但不限于埃希氏菌、棒杆菌，更优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。上述重组微生物，按照包括如下步骤的方法制备：将宿主菌中γ-谷氨酰激酶氨基酸序列对应于序列1的第150位氨基酸进行突变，得到重组微生物。上述突变为将宿主菌中γ-谷氨酰激酶氨基酸序列对应于序列1的第150位氨基酸突变为如下任一氨基酸；所述如下任一氨基酸为N、T、K、Q、H、P、R、E、A、Y、S、C、W和M中任一种。上述宿主菌包括但不限于埃希氏菌、棒杆菌，更优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。上述突变方法可以为现有常规的突变方法，也可以按照本专利技术实施例中的方法进行突变。本专利技术的实施例中的例子为：将实施例中制备的pCas9gRNA-proB2载体、pRecT载体和150-1单链DNA至150-8单链DNA导入目的菌ATCC13032，得到各种表达突变体的重组菌SLCgP54至SLCgP67。上述蛋白或上述多核苷酸或上述表达盒或重组载体或重组微生物在制备L-脯氨酸或其衍生物中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术还有一个目的是提供一种生产L-脯氨酸或其衍生物的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：发酵培养上述重组微生物，得到L-脯氨酸或其衍生物。上述方法还包括如下步骤：收集发酵产物，从所述发酵产物中分离脯氨酸或其衍生物。上述L-脯氨酸衍生物为羟基脯氨酸。本专利技术提供了新的ProB突变体蛋白，将含有该蛋白的谷氨酸棒杆菌进行发酵，解除L-脯氨酸反馈抑制，提高了脯氨酸的产量，为脯氨酸及其衍生物生产菌株构建提供了全新的思路。附图说明图1为pCas9gRNA-ccdB质粒图谱。图2为pRecT质粒图谱。具体实施方式本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。本文所用的选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。本文所用的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。本公开中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列（CodingSequence），能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。蛋白编码基因包括但不限于用于编码参与合成L-脯氨酸及其衍生物的酶，在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码参与合成L-脯氨酸及其衍生物的酶，如γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、脯氨酸4-羟化酶、脯氨酸3-羟化酶、脯氨酸转运蛋白等等。本文所用的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.γ-谷氨酰激酶突变体蛋白，为如下A或B：/nA）所述的蛋白为将γ-谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ-谷氨酰激酶活性的蛋白；/nB）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ-谷氨酰激酶活性的由A衍生的蛋白；/n所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列的第150位残基由缬氨酸突变为天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸和蛋氨酸中任一种。/n

【技术特征摘要】
1.γ-谷氨酰激酶突变体蛋白，为如下A或B：
A）所述的蛋白为将γ-谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ-谷氨酰激酶活性的蛋白；
B）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ-谷氨酰激酶活性的由A衍生的蛋白；
所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列的第150位残基由缬氨酸突变为天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸和蛋氨酸中任一种。


2.根据权利要求1所述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白，其特征在于：所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基由缬氨酸突变为天冬酰胺、苏氨酸、组氨酸、酪氨酸中的任一个。


3.根据权利要求1所述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白，其特征在于：所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基由缬氨酸突变为天冬酰胺或苏氨酸。


4.一种具有γ-谷氨酰激酶活性的组合物，其包括含有权利要求1-3任一所述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的蛋白组合物或含有权利要求1-3任一所述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的融合蛋白。


5.编码权利要求1-3任一所述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的多核苷酸或编码权利要求4中所述组合物的多核苷酸。


6.含有编码权利要求1-3任一所述γ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，刘娇，王钰，孙际宾，刘莫识，周文娟，郭轩，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12