莲子心中O-甲基转移酶及其编码基因在单/双苄基异喹啉类生物碱生物合成中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体公开了莲子心中O

【技术实现步骤摘要】
莲子心中O
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甲基转移酶及其编码基因在单/双苄基异喹啉类生物碱生物合成中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及莲子心中O
‑
甲基转移酶及其编码基因在单/双苄基异喹啉类生物碱生物合成中的应用。

技术介绍

[0002]莲子心是莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)成熟种子中的干燥幼叶及胚根。作为传统中药，具有清心安神，交通心肾，涩精止血的功效，用于热入心包，神昏谵语，心肾不交，失眠遗精，血热吐血等病症的治疗。现代药理学研究表明，苄基异喹啉类生物碱(BIAs)是其中主要药效成分，尤其是双苄基异喹啉类生物碱，例如，甲基莲心碱(neferine)具有降糖、降压、镇静、抗心律失常、等多种药理活性，对肝癌、肺癌、卵巢癌等具有潜在治疗作用。
[0003]目前虽有少许关于莲O
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甲基转移酶的报道，但尚未发现具有催化双苄基异喹啉类生物碱功能的O
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甲基转移酶。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供甲基莲心碱生物合成路径中的一种O
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甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用。
[0005]本专利技术发现的莲子心中O
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甲基转移酶主要催化异莲心碱生成甲基莲心碱，甲基化作用主要发生在双苄基类苄基异喹啉类生物碱母核上。这是目前发现的第一个催化莲中双苄基类母核的O
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甲基转移酶。该酶的发现极大地推进了甲基莲心碱(neferine)的生物合成路径的研究，同时也为其成为新药提供充足的原料。
[0006]具体地，本专利技术的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供莲子心中O
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甲基转移酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在单苄基异喹啉类生物碱或双苄基异喹啉类生物碱生物合成中的应用；所述莲子心中O
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甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0008]所述单苄基异喹啉类生物碱为乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)或亚美罂粟碱(Armepavine)；所述双苄基异喹啉类生物碱为甲基莲心碱(neferine)。
[0009]所述应用中，以S
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腺苷甲硫氨酸为甲基供体进行酶促反应来制备所述单苄基异喹啉类生物碱或双苄基异喹啉类生物碱。
[0010]在制备乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)、亚美罂粟碱(Armepavine)和甲基莲心碱(neferine)时，所述酶促反应的底物分别为去甲乌药碱(Norcoclaurine)、乌药碱(Coclaurine)、N
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甲基乌药碱(N
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MethylCoclaurine)和异莲心碱(isoliensinine)
[0011]所述莲子心中O
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甲基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012]所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种制备苄基异喹啉类生物碱的方法，所述苄基异喹啉类生物碱为单苄基异喹啉类生物碱或双苄基异喹啉类生物碱；所述单苄基异喹啉类生物碱为乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)或亚美罂粟碱(Armepavine)；所述双苄基异喹啉类生物碱为甲基莲心碱(neferine)；
[0014]以S
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腺苷甲硫氨酸为甲基供体，通过酶促反应进行制备，所述酶促反应的催化酶为莲子心中O
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甲基转移酶，所述莲子心中O
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甲基转移酶如上所述。
[0015]本专利技术的方法中，在制备乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)、亚美罂粟碱(Armepavine)和甲基莲心碱(neferine)时，所述酶促反应的底物分别为去甲乌药碱(Norcoclaurine)、乌药碱(Coclaurine)、N
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甲基乌药碱(N
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MethylCoclaurine)和异莲心碱(isoliensinine)。
[0016]本专利技术的有益效果至少在于：
[0017]本专利技术从莲子心中首次发现一个O
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甲基转移酶可以催化双苄基异喹啉母核，对甲基莲心碱生物合成途径的研究具有重要意义。同时，可为多种苄基异喹啉类生物碱的生物合成提供高效、特异的甲基化生物催化剂。该酶的功能鉴定，将极大地推进莲苄基异喹啉生物碱生物合成路径的研究，为相关新药创制提供充足的原料保障。
附图说明
[0018]图1是本专利技术系统发育进化树分析结果。
[0019]图2是本专利技术实施例2中候选Nn7OMT重组蛋白的SDS
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PAGE电泳图，其中M，蛋白maker；1,2,3,4为20mM的洗脱液，5,6,7,8为50mM的洗脱液。
[0020]图3是本专利技术实施例2中Nn7OMT的酶活催化反应过程及质谱图。图中，A表示Nn7OMT对底物Norcoclaurine的催化反应过程示意图(上图)和质谱图(下图)，B表示Nn7OMT对底物Coclaurine的催化反应过程示意图(上图)和质谱图(下图)，C表示Nn7OMT对底物N
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MethylCoclaurine的催化反应过程示意图(上图)和质谱图(下图)，D表示Nn7OMT对底物Isoliensinine的催化反应过程示意图(上图)和质谱图(下图)。
具体实施方式
[0021]下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。
[0022]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]本专利技术中，Norcoclaurine为去甲乌药碱、Coclaurine为乌药碱、N
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MethylCoclaurine为N
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甲基乌药碱、Norarmepavine为N
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去甲亚美罂粟碱、Armepavine为亚美罂粟碱、Lotusine为莲心季铵碱，Asimilobine为巴婆碱、N
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MethlyAsimilobine为N
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甲基巴婆碱、liensinine为莲心碱、isoliensinine为异莲心碱、neferine为甲基莲心碱。
[0024]实施例1基因克隆的方法和步骤
[0025](1)Blast筛选基因及系统发育分析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.莲子心中O
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甲基转移酶或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在单苄基异喹啉类生物碱或双苄基异喹啉类生物碱生物合成中的应用；所述莲子心中O
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甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述单苄基异喹啉类生物碱为乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)或亚美罂粟碱(Armepavine)；所述双苄基异喹啉类生物碱为甲基莲心碱(neferine)。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以S
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腺苷甲硫氨酸为甲基供体进行酶促反应来制备所述单苄基异喹啉类生物碱或双苄基异喹啉类生物碱。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在制备乌药碱(Coclaurine)、N
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去甲亚美罂粟碱(Norarmepavine)、亚美罂粟碱(Armepavine)和甲基莲心碱(neferine)时，所述酶促反应的底物分别为去甲乌药碱(Norcoclaurine)、乌药碱(Coclaurine)、N
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甲基乌药碱(N
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MethylCoclaurine)和异莲心碱(isoliensinine)。4.根据权利要求1
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3任一项所述的应用，其特征在于，所述莲子心中O
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈莎，俞越童，刘安，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：