糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素-3-O鼠李糖苷中的应用制造技术

本发明专利技术涉及糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素

【技术实现步骤摘要】
糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素
‑3‑
O鼠李糖苷中的应用


[0001]本专利技术属于中医药的生物制药
，具体涉及一种PSPG结构域替换的糖基转移酶AtUGT78D2
‑
D1 PSPG突变体及其在高选择性制备槲皮素
‑3‑
O鼠李糖苷中的应用。

技术介绍

[0002]槲皮素（Quercetin）是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，具有C6
‑
C3
‑
C6 碳骨架的苯并（γ）
‑
吡喃酮结构，槲皮素可调节众多与疾病进展有关的细胞内外信号通路，是天然的抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抗癌、预防和治疗心脑血管疾病等作用，但是槲皮素由于其溶解度差和较低的生物利用度限制了在临床上的应用。
[0003]构效关系研究显示：糖链的存在或糖基化修饰还能显著提高化合物的水溶性及稳定性，改善目标化合物的生物活性，增加其生物利用度, 增强靶向性作用并减少毒副作用等。糖基化修饰糖种类的也能影响目标化合物的靶向性；种类多样的糖基化修饰中，鼠李糖基化修饰是很重要的一种，且取代形式多样。且药理学研究显示，槲皮素在经过鼠李糖基化后表现出了显著的药理学活性，例如：槲皮素
‑3‑
O
‑
鼠李糖苷对人流感 A/WS/33 病毒也有较好的抑制作用；也能够有效预防大鼠的腹泻，稳定大鼠结肠内液体的运输，最大限度降低对结肠的损害；此外， 12.5~50μg/mL槲皮素
‑3‑
O
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鼠李糖苷能减轻阿霉素（ADR）对心肌细胞损伤，具有明显的心肌细胞保护作用，对该类化合物进行研究具有重要意义。
[0004]槲皮素
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O
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鼠李糖苷的结构式如下：
[0005]植物天然糖苷糖基化相关的糖基转移酶多属GT1超家族，主要是UDP糖依赖性的GT
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B折叠模式的糖基转移酶。GT
‑
B型糖基转移酶在C
‑
端序列非常保守，存在一段44个氨基酸的富含谷氨酸和甘氨酸残基的植物次级代谢产物相关PSPG模序，用于结合糖基供体，该保守序列已被用作植物糖苷合成相关酶的常规鉴定。而N
‑
端序列具有多变的螺旋和环状结构以适应种类繁杂的受体底物，N
‑
端序列的不确定性赋予了糖基转移酶泛杂的底物谱，也使得底物催化功能预测非常困难，理论上通过交换具有不同底物特异性的N
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端和C
‑
端PSPG结构域可以挖掘具有新催化特性的糖基转移酶。但该方法局限于亲本相似性很高的酶序列，即该PSPG结构域替换的策略在两个相似性较低的糖基转移酶之间并不适用。
[0006]此外，鼠李糖基转移酶通常以NAD
‑
鼠李糖为糖供体，将鼠李糖基转移到目标受体上，参与鼠李糖苷类化合物的合成。目前报道的与活性小分子鼠李糖基化修饰相关的鼠李糖基转移酶主要来自于植物还有少部分来自于微生物，通过生物信息学分析及各种分子生
物学手段，已从植物及微生物中鉴定了多种鼠李糖基转移酶基因。如 Jones（J Biol Chem, 2003, 278(45): 43910
‑
8.）等通过同源序列比对在拟南芥中克隆得到可以鼠李糖基化槲皮素和山奈酚的3
‑
OH，分别生成槲皮素
‑3‑
O
‑
鼠李糖苷和山奈酚
‑3‑
O
‑
鼠李糖苷的UGT78D1。Rojas （Plant Mol Biol, 2014, 84(3): 287
‑
300.）大豆中克隆得到类黄酮醇
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O
‑
葡糖苷（1
→
6）鼠李糖基转移酶GmF3G6
’
R。Casas 等（Plant Cell, 2016, 28(6): 1297
‑
309.）从玉米 Sm2 基因座中克隆得到可催化异荭草素鼠李糖基化生成2
’‑
O
‑
鼠李糖基异荭草素的 UGT91L1。
[0007]综上所述，植物来源的鼠李糖基转移酶已取得了较大进展，但仍存在如下问题：(1)目前已鉴定功能的鼠李糖基转移酶仍为少数，因此还无法通过多序列比对分析来总结出鼠李糖基转移酶的特征性保守序列；(2)无论是体内或体外的鼠李糖基化反应，都需要有鼠李糖基供体的参与，如UDP
‑
鼠李糖（UDP
‑
Rha），由于其来源非常有限，且合成路线复杂，这在很大程度上限制了更多鼠李糖基转移酶的鉴定。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于针对现有鼠李糖基转移酶来源有限、底物浓度差、反应选择性差，且催化过程中需要添加外源昂贵的UDP
‑
Rha作为糖供体等问题，提供一种糖基转移酶突变体。
[0009]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：通过将葡萄糖基转移酶AtUGT78D2氨基酸序列C
‑
端PSPG结构域的44个氨基酸替换为糖基转移酶AtUGT78D1的C
‑
端PSPG结构域的44个氨基酸，获得结构域工程改造的糖基转移酶AtUGT78D2
‑
D1PSPG；再将糖基转移酶AtUGT78D2
‑
D1PSPG中第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的一个或多个点突变为另一种氨基酸残基，得到所述糖基转移酶突变体；其中，第350位蛋氨酸突变为苏氨酸、第353位天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第374位甘氨酸突变为半胱氨酸、第377位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第378位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第381位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；所述糖基转移酶AtUGT78D2
‑
D1PSPG的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]作为一种优选的实施方式，所述突变体为糖基转移酶AtUGT78D2
‑
D1PSPG的第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的两个位点或三个位点的组合突变。
[0011]作为一种优选的实施方式，所述突变体为M350T/I377F、M350T/N381Q、N353F/G374C、N353F/I377F、N353F/L378F或N353F/N381Q。
[0012]本专利技术的另一目的在于提供上述突变体在制备槲皮素
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O鼠李糖苷中的应用。
[0013]作为一种优选的实施方式，以蔗糖为底物，利用三酶偶联催化反应体系合成槲皮素
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O
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鼠李糖苷产物；所述三酶偶联催化合成槲皮素
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O
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鼠李糖苷的体系包括：所述糖基转移酶突变体、拟南芥来源的蔗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，通过将葡萄糖基转移酶AtUGT78D2氨基酸序列C
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端PSPG结构域的44个氨基酸替换为糖基转移酶AtUGT78D1的C
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端PSPG结构域的44个氨基酸，获得结构域工程改造的糖基转移酶AtUGT78D2
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D1PSPG；再将糖基转移酶AtUGT78D2
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D1PSPG中第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的一个或多个点突变为另一种氨基酸残基，得到所述糖基转移酶突变体；其中，第350位蛋氨酸突变为苏氨酸、第353位天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第374位甘氨酸突变为半胱氨酸、第377位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第378位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第381位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；所述糖基转移酶AtUGT78D2
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D1PSPG的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为糖基转移酶AtUGT78D2
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D1PSPG的第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的两个位点或三个位点的组合突变。3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为M350T/I377F、M350T/N381Q、N353F/G374C、N353F/I377F、N353F/L378F或N353F/N381Q。4.权利要求1~3任一项所述突变体在制备槲皮素
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O鼠李糖苷中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以蔗糖为底物，利用三酶偶联催化反应体系合成槲皮素
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O
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【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，徐晓丽，储建林，李玉婷，陈璐娜，王文文，钦松，吴斌，高振，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：