一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程和细胞学领域，具体涉及一种AAV受体敲除方法、敲除AAV受体的HEK293细胞株及其应用；所述被敲除的AAV受体为KIAA0319L；所述敲除方法包括：构建靶向AAVR基因组序列的sgRNA载体；转染293T细胞，培养得到各克隆细胞；Surveyor基因突变分析试验；选出AAVR突变的单克隆；再选择出高产AAV的AAVR突变细胞株；鉴定其它潜在突变位点的突变情况；把无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。本发明专利技术的被敲除的AAV受体的HEK293细胞株生产AAV的最终产量比常规HEK293产量高出约50％。

A method of knocking out AAV receptor, HEK293 cell line knocking out AAV receptor and its application

The present invention relates to gene engineering and biology, in particular to a AAV receptor knockout method, on HEK293 cell lines except AAV receptor and its application; the knockout of AAV receptor KIAA0319L; the knockout method comprises: constructing sgRNA targeting vector AAVR genome sequences were transfected into 293T cells, cultured; the analysis of the test cell clone; Surveyor gene mutation; selected monoclonal AAVR mutation; and then select high AAV AAVR mutant cell lines; identification of other potential mutation mutation sites; the other mutation cell line to expand its production base. The final production of AAV produced by the knockout AAV receptor HEK293 cell line is about 50% higher than that of conventional HEK293 production.

【技术实现步骤摘要】
一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用
本专利技术涉及基因工程和细胞学领域，具体涉及一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用。
技术介绍
目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键，作为基因载体，需要具有安全性、有效性、特异性。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。由于AAV的生产得率长期以来提升缓慢，因而临床应用的普及程度也受此制约。随着近几年来第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市，SparkTheraputics公司的治疗先天性失明的SPK-RPE65三期临床表现优秀，AAV作为基因治疗载体的方向与道路已完全被证明，但AAV的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。一个需要全身性转导的遗传疾病需要约1x1015AAV基因组拷贝数(GC)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。生产上，如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得1x1013GC的生产效率来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除了AAV受体的HEK293细胞株，其特征在于，所述AAV受体为KIAA0319L，所述敲除了AAV受体的HEK293细胞株在常规培养条件下与原始的HEK293细胞并无显著形态学差异。

【技术特征摘要】
1.一种敲除了AAV受体的HEK293细胞株，其特征在于，所述AAV受体为KIAA0319L，所述敲除了AAV受体的HEK293细胞株在常规培养条件下与原始的HEK293细胞并无显著形态学差异。2.一种通过CRISPR技术敲除HEK293细胞的AAV受体KIAA0319L的方法，其特征在于，步骤包括：(1)设计靶向AAVR基因组的靶序列，利用sgRNA克隆骨架载体PG-CMV.SpCas9-U6.(Sp)sgRNA构建靶向AAVR基因组序列的sgRNA载体；(2)将(1)中的靶序列的sgRNA载体分别转染293T细胞，再经培养得到各克隆细胞，稀释，分转到反应孔板中；(3)将(2)中的细胞生长15天后得到的单克隆，经消化，用完全培养基中和，一半细胞悬液冻存，另一半细胞悬液提取基因组DNA用于Surveyor基因突变分析试验；(4)Surveyor基因突变分析试验鉴定所提取的单克隆的基因组DNA，确认AAVR突变的单克隆，即为敲除了AAV受体的293T细胞株；(5)复苏(3)中AAVR突变的单克隆冻存细胞到反应孔板中，作AAV生产的产量比较，选择出高产AAV的AAVR突变HEK293细胞株；(6)PCR测序全面鉴定(5)中所得高产AAV的AAVR突变HEK293细胞株基因组中其它潜在突变位点的突变情况；(7)把(6)中鉴定无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体操作包括：(1)、构建靶向AAVR基因组序列的U6启动子驱动下的sgRNA载体：设计2个KIAA0319L基因的靶序列：AR1：GAGGTGACACAATAGCAATG、AR2：GGTAGGGGTAGCATAACTGT；用PG-CMV.SpCas9-U6.(Sp)sgRNA作为sgRNA克隆骨架载体；将所述靶序列分别克隆至所述骨架载体中；(2)将(1)中所得的两个不同的靶序列的载体分别转染293T细胞，再经培养得到各克隆细胞，稀释，分转到反应孔板中；(3)待(2)中的生长15天后得到单克隆；用50ul0.01％Trypsin胰酶消化克隆1分钟，用50ul完全培养基中和，取50ul细胞悬液提取基因组DNA作后面Surveyor基因突变分析试验；剩余的50ul细胞悬液加入含有10％DMSO的完全培养基250ul，冻存-80度超低温冰箱；(4)Surveyor基因突变分析试验鉴定所提取的单克隆的基因组DNA，选出AAVR突变的单克隆，即敲除了AAV受体的293T细胞株；(5)再复苏(3)中确认为AAVR突变的单克隆冻存细胞到6孔板中，扩大培养至3x106个细胞/孔，每孔冻存2.5x106个细胞，每孔剩余的0.5x106个细胞分到24孔板的一个孔中，作AAV生产的产量比较；(6)PCR测序全面鉴定(5)中的高产AAV的AAVR突变HEK...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华鹏，
申请(专利权)人：广州派真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44