一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体，包含胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中胞外识别区为scFv序列，铰链区为CD8区域，跨膜区为CD8跨膜区或CD28跨膜区中的任一个，胞内信号区包含CD28、4‑1BB、CD3ζ中的至少一个；上述嵌合抗原受体具体为L6‑28Z、L6‑BBZ和L6‑28BBZ，其分别由SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.14所示序列的核酸编码；本发明专利技术还提供一种包含上述核酸的重组表达载体及其宿主细胞、构建方法、在哺乳动物肿瘤治疗中的应用，本发明专利技术所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体可以通过修饰T细胞，并使特异性CAR‑T细胞高效特异的治疗实体肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及生物免疫领域，具体地，本专利技术涉及一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(CAR)由抗原识别区、跨膜区、胞内信号区构成，一般通过病毒转导或者电穿孔，使CAR分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞。CAR-T细胞通过胞外抗原识别区识别肿瘤抗原，招募T细胞到肿瘤细胞表面，并通过胞内信号区激活T细胞，使T细胞行使杀伤作用，以杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。CAR分子的设计根据胞内信号区的不同经过了四代的发展，其中第一代CAR分子仅包含CD3ζ；第二代CAR分子除CD3ζ之外还包含一个共刺激因子，例如CD28，CD137，OX40等；第三代CAR分子同时包含串联的两个共刺激因子；第四代CAR分子中包含了IL-12等能改善肿瘤微环境的细胞因子。CAR-T通过靶向CD19分子在血液肿瘤方向取得突破性进展，部分研究中有效率达到了90％。但是，CAR-T在实体瘤领域一直没有突破，所以迫切需要新的肿瘤靶点，新的CAR分子设计以促进其在实体瘤领域的应用。TM4SF1(transmembrane-4Lsixfamilymember1)是一个整合在细胞质膜上的糖蛋白，在多种癌症细胞中高度表达，包括肝细胞癌，非小细胞肺癌等；TM4SF1还高度表达在人癌症血管的内皮细胞上。TM4SF1同时在多种组织器官中存在微弱的表达。TM4SF1功能在于能够调控多种肿瘤细胞的运动性和粘附性。由于TM4SF1在多种肿瘤细胞中高表达同时与肿瘤内血管的生成有关，所以是一个潜在的肿瘤治疗靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种新的通过靶向TM4SF1的CAR分子，并证明其在实体瘤治疗中的潜在应用。具体的说，本专利技术提供一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体(CAR)，这种CAR分子通过靶向肿瘤细胞表面的TM4SF1蛋白并激活T细胞下游的信号通路，赋予T细胞杀伤带有TM4SF1靶点肿瘤细胞的能力。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其包括包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区；其中，胞外识别区为抗-TM4SF1抗体序列。为了进一步优化上述TM4SF1特异性嵌合抗原受体，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述抗-TM4SF1抗体序列为一种结合TM4SF1的单链可变区(scFv)序列，更优选地，在本专利技术一实施例中，该抗体序列为来源于本领域已公开的TM4SF1单克隆抗体L6，该TM4SF1单克隆抗体L6包括如SEQIDNO.1所示的重链可变区(VH)氨基酸序列和如SEQIDNO.2所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列。进一步地，根据scFv的构成规则，VH和VL序列通过一段柔性linker氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS连接到一起，形成scFv序列。优选地，所述铰链区为CD8hinge区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。优选地，所述跨膜区所述跨膜区为CD8跨膜区或CD28跨膜区中的任一个，其中，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。优选地，所述胞内信号区包含CD28、4-1BB、CD3ζ中的至少一个；更优选地，所述胞内信号区为CD28、4-1BB和CD3ζ中的至少两个的串联。其中，所述CD28的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。进一步地，所述胞内信号区为T细胞信号传导激活区域。优选地，基于以上TM4SF1CAR分子的结构，本专利技术所述的该嵌合抗原受体包括L6-28Z、L6-BBZ、L6-28BBZ中的任一个，其结构如图1所示；其中，所述L6-28Z的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述L6-BBZ的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，所述L6-28BBZ的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。可以理解的是，也可根据本领域适用的其他结构来组成TM4SF1嵌合抗原受体。具体地，在不同的CAR分子中，其跨膜区可相同，也可不同；其胞内信号区可相同，也可不同。优选地，在本专利技术一具体实施例中，若TM4SF1嵌合抗原受体为L6-28Z，则其跨膜区为CD8，其胞内信号区为CD28-CD3ζ；若TM4SF1嵌合抗原受体为L6-BBZ，则其跨膜区为CD8，其胞内信号区为4-1BB-CD3ζ；若TM4SF1嵌合抗原受体为L6-28BBZ，则其跨膜区为CD28，其胞内信号区为CD28-4-1BB-CD3ζ。本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述TM4SF1特异性嵌合抗原受体的核酸。优选地，所述核酸的核苷酸序列包括SEQIDNO.12～SEQIDNO.14所示序列。更具体地说，SEQIDNO.12所示序列的核酸编码L6-28Z，SEQIDNO.13所示序列的核酸编码L6-BBZ，SEQIDNO.14所示序列的核酸编码L6-28BBZ。CAR分子的氨基酸序列及其编码核酸序列如下表所示：本专利技术的第三个目的是提供一种含有编码上述TM4SF1特异性嵌合抗原受体的核酸的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等；更优选地，在本专利技术一实施例中，原始重组表达载体为慢病毒。具体的，在该实施例中所使用的载体为慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-CopGFP(以下简写为pCDH)，其图谱见图2。在该载体中，CAR分子的表达由EF1启动子驱动转录表达，带有GFP标记基因作为慢病毒转导的标志。CAR慢病毒载体质粒在辅助包装质粒pSPAX2和VSV-G包膜质粒pMD2.G存在的情况下，共转染HEK293T细胞，即可包装为带有CAR分子的慢病毒。本专利技术的第四个目的是提供一种含有编码上述TM4SF1特异性嵌合抗原受体的核酸的重组表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为T细胞或含有T细胞的细胞群。本专利技术还涉及一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤、重组表达载体的包装步骤以及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。最后，本专利技术还提供一种上述TM4SF1特异性嵌合抗原受体，上述编码TM4SF1特异性嵌合抗原受体的核酸，上述重组表达载体以及宿主细胞在哺乳动物肿瘤治疗中的应用。优选地，哺乳动物实体肿瘤包括但不限于，肾脏肿瘤、神经母细胞瘤、生殖细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、肝脏肿瘤、胸腺瘤、肺母细胞瘤、胰母细胞瘤、血管瘤等。更具体的说，上述应用为一种TM4SF1CAR-T细胞，其通过慢病毒介导的转导使得T细胞带有TM4SF1CAR，从而赋予了T细胞识别TM4SF1分子的能力，并靶向TM4SF1阳性的哺乳动物实体肿瘤。在一个实施例中，将TM4SF1CAR-T细胞与表达TM4SF1的肿瘤细胞系Calu-3，Calu-6-TM4SF1共孵育，结果显示TM4SF1CAR-T细胞能够在靶细胞的刺激下大量的产生IFN-γ；但是却不能在与TM4SF1阴性的细胞系Calu-6共孵育时产生IFN-γ；同时非TM4SF1靶向的CAR-T细胞19-28BBZ不能够在TM4SF1阳性细胞刺激下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区；其中，胞外识别区为抗‑TM4SF1抗体序列。

【技术特征摘要】
1.一种TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区；其中，胞外识别区为抗-TM4SF1抗体序列。2.根据权利要求1所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗-TM4SF1抗体序列为一种结合TM4SF1的单链可变区序列。3.根据权利要求1所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗-TM4SF1抗体序列为TM4SF1单克隆抗体L6，其包括如SEQIDNO.1所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO.2所示的轻链可变区氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列通过一段为GGGGSGGGGSGGGGS的linker氨基酸序列连接。5.根据权利要求1所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8hinge区域。6.根据权利要求5所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8hinge区域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。7.根据权利要求1所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD8跨膜区或CD28跨膜区中的任一个。8.根据权利要求7所述的TM4SF1特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑞栋，刘根桃，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科医联创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31