重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料制造技术

一种重组载体及应用该重组载体产生的转基因鱼卵与生物材料，可提供能够于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。

Recombinant vector and transgenic fish eggs and biological material using the recombinant vector

Transgenic fish eggs and biological materials to produce a recombinant vector and application of the recombinant vector, transgenic fish can provide to specific parts of secretion of recombinant human procollagen and collagen, with specific parts to the secretion of recombinant human collagen or collagen before the fish body as a biological material or purification of the recombinant human collagen or before collagen.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为一种生物医学材料的制备技术，特别是一种重组载体及应用该重组载体而产生的转基因鱼卵与生物材料。先前技术由于胶原蛋白是生物医学材料的重要组成材料，主要包括使组织生长、整型、烧烫伤敷料、伤口愈合等功能，并且市场规模不断地扩大，因此，开发更具医疗价值及更多样性的胶原蛋白及其衍生物，以应用于各种用途，是现今研发者所希望解决的课题。目前生产重组胶原蛋白的表达系统包括大肠杆菌（Escherichiacoli；E.coli）、酵母菌、哺乳动物细胞株、昆虫细胞株、转基因动物以及转基因植物。然而，大肠杆菌表达系统没有翻译后修饰。酵母菌表达系统缺乏脯氨酸4-羟化酶活性，但甲醇酵母中的胶原蛋白产量却又是这些表达系统中最高的。哺乳动物细胞株的表达系统产量低且受限于特定细胞类型。昆虫细胞的表达系统中脯氨酸4-羟化酶活性又低。而转基因动物（如，蚕或小鼠）以及转基因植物（如，烟草），其胶原蛋白产物会过度交联。目前已建立有含有编码人类脯氨酸4-羟化酶以及胶原蛋白的基因的杆状病毒表达系统（参照美国专利第5,077,214号以及第5,593,859号）。然而，经转染的昆虫细胞在72小时内死亡，造成仅有暂时性的重组胶原蛋白生产。此外，由于胞溶作用，因此将很难回收或纯化重组胶原蛋白。而且，杆状病毒对于内质网或高尔基氏体的破坏更限制了胶原蛋白的生产。
技术实现思路
在一实施例中，一种生物材料包括：由鱼体生产并获得的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。在一些实施例中，此生物材料更包括鱼体的至少鱼鳞，并且各鱼鳞具有表达的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。在一些实施例中，重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由转移到鱼体中的人类胶原蛋白基因表达的。在另一实施例中，一种转基因鱼卵包括鱼类染色体以及重组载体。重组载体整合到鱼类染色体中，并且此重组载体包括人类胶原蛋白基因。在又一实施例中，一种重组载体包括上游基因以及人类胶原蛋白基因。上游基因是由鱼体获得，而人类胶原蛋白基因是连接在上游基因的下游。其中，上游基因可为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合。在一些实施例中，重组载体更包括报道基因，并且此报道基因是连接在人类胶原蛋白基因的下游。综上，根据本专利技术的重组载体及应用其产生的转基因鱼卵和生物材料可提供能于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。所述生物材料已在位于德国D-38124布伦瑞克茵荷芬斯特街7B号的德国微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏日期为2013年8月20日，保藏编号为DSM27616，分类命名为：斑马鱼角蛋白4启动子在tol2载体连接第1型α1人类胶原蛋白基因（zebrafishKeratin4promoterlinkhumanCollagen1A1geneintol2vector，pT2-zK4hC1A1）。附图简要说明图1为根据本专利技术一实施例的转基因鱼卵的转化方法的流程图。图2为根据本专利技术一实施例的重组载体的示意图。图3为图1步骤S10的一实施例的详细流程图。图4为图3步骤S110的一实施例的详细流程图。图5为图3步骤S120的一实施例的详细流程图。图6为图3步骤S130的一实施例的详细流程图。图7为图3步骤S140的一实施例的详细流程图。图8为具有第1型人类胶原蛋白基因的重组质粒的一实施例的示意图。实施方式以下所述的「第一」至「第二十三」等序号用语是用于区别所指的组件，而非用于排序或限定所指组件的差异性，且也非用于限制本专利技术的范围。参照图1，一种转基因鱼卵的转化方法包括构建具有人类胶原蛋白基因的重组载体（步骤S10）、利用适当的限制性酶（RestrictionEnzyme）将构建好的重组载体（RecombinantVector）变成线性（步骤S20）、以及将线性的重组载体引入鱼类的胚胎中以整合到胚胎中的鱼类染色体中（步骤S30）。在此，参照图2，重组载体更具有上游基因UG，而人类胶原蛋白基因hCG是连接在此上游基因UG的下游。此上游基因UG至少包括可特异性在在特定组织驱动下游基因序列（即，人类胶原蛋白基因hCG）表达（expression）的启动子（promoter）、作用于此启动子的增强子（enhancer）或其组合。换言之，将此重组载体引入至鱼体之后，此重组载体能在鱼体上表达人类前胶原蛋白或胶原蛋白（procollagenorcollagen）。在此，激活子存在于鱼体中且具有组织特异性的表达。增强子存在于鱼体中。在一些实施例中，启动子例如可为角蛋白4（keratin4；K4）启动子、角蛋白5（keratin5；K5）启动子或角蛋白1c6（krtt1c6）启动子。其中，角蛋白4启动子为SEQIDNO:1所示的序列。角蛋白1c6启动子为SEQIDNO:2所示的序列。在一些实施例中，人类胶原蛋白基因hCG可为单股或三股的人类胶原蛋白的氨基酸序列。人类胶原蛋白基因hCG可为第1型至第28型中的任一种或其配体。人类胶原蛋白基因hCG可为单链或多链。举例来说，第1型人类胶原蛋白具有二条α1链以及一条α2链，而第2型人类胶原蛋白具有三条α1链。人类胶原蛋白的配体总体为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。其中，第1型人类胶原蛋白基因为SEQIDNO:3及4所示的序列。第2型人类胶原蛋白基因为SEQIDNO:5所示的序列。在此，示范性列出第1及2型人类胶原蛋白基因的单一链的基因序列，但本专利技术不限于此。在一些实施例中，重组载体更具有报道基因RG，并且此报道基因RG是连接在人类胶原蛋白基因CG的下游。在此，报道基因RG可为萤光素酶（luciferase）基因、荧光蛋白（fluorescentprotein）基因或lacZ（β-半乳糖苷酶；β-galactosidase）基因等。其中，荧光蛋白基因可为绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein；GFP）基因、修饰绿色荧光蛋白（modifiedgreenfluorescentprotein）基因、增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein；EGFP）基因、红色荧光蛋白（redfluorescentprotein；RFP）基因、增强红色荧光蛋白（enhancedredfluorescentprotein，ERFP）基因、蓝色荧光蛋白（bluefluorescentprotein；BFP）基因、增强蓝色荧光蛋白（enhancedbluefluorescentprotein；EBFP）基因、黄色荧光蛋白（yellowfluorescentprotein；YFP）基因、增强黄色荧光蛋白（enhancedyellowfluorescentprotein；EYFP）基因、靛色荧光蛋白（cyanfluorescentprotein；CFP）基因或增强靛色荧光蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物材料，包括：由鱼体获得的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。

【技术特征摘要】
2012.08.30 US 61/694,8771.一种生物材料，包括：由鱼体获得的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的生物材料，进一步包括该鱼体的至少鱼鳞，其中各
该鱼鳞具有表达的该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的生物材料，其中该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白
是由人类胶原蛋白基因在该鱼体表达的。
4.一种转基因鱼卵，包括：
鱼类染色体；以及
重组载体，其整合到该鱼类染色体中，其中该重组载体包括人类胶
原蛋白基因。
5.如权利要求4所述的转基因鱼卵，其中该重组载体进一步包括上游基<...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿全福，龚纮毅，吴金洌，赖弘基，林建成，陈永貴，周正鸿，
申请(专利权)人：柏登生医股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71