组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途及细胞培养基制造技术

本公开涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途，其中，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养或原代肝脏细胞体外培养，其中所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为CI‑994、MS‑275或FK228。本公开还提供了多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养体系以及原代肝脏细胞体外培养基。利用本公开提供的技术方案能显著促进分化所得到的肝脏细胞的质量和减缓原代肝脏细胞体外培养过程中肝脏特征的丢失。

Use of histone deacetylase inhibitors in cell culture and cell culture medium

The invention relates to a histone deacetylase inhibitor in cell culture uses, among them, the use of pluripotent stem cells cultured in vitro to differentiation in vitro cultured liver cells or primary liver cells, wherein the histone deacetylase inhibitor for CI 994, MS 275 or FK228. The present invention also provides an in vitro directed differentiation culture system of pluripotent stem cells to liver cells and a culture medium for primary liver cells in vitro. The technique provided by the present invention can significantly promote the differentiation of the quality of the obtained liver cells and slow the loss of liver characteristics in the process of primary liver cell culture in vitro.

【技术实现步骤摘要】
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途及细胞培养基
本公开涉及细胞培养领域，具体地，涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途及细胞培养基。
技术介绍
多能干细胞(pluripotentstemcells，PSCs)在体外特定生长因子诱导下可定向分化得到肝脏细胞，是肝脏细胞生物功能分析、药物筛选、毒理检测、体内移植等操作的潜在的重要细胞来源。但目前由多能干细胞分化所得到的肝脏细胞大都存在以下缺陷：1)细胞成熟性不够，分化得到的肝脏细胞大都处于发育的幼稚期，表现为幼稚肝脏细胞标示物AFP(alphafetalprotein)蛋白水平较高，一些解毒酶(如CYP3A4)活性较低等；2)细胞群体处于杂合状态，体外分化效率无法达到100％，在主要细胞群体外混杂有多种其他细胞类型，表现为肝脏细胞标示物(如albumin白蛋白)染色比例<100％；3)不同多能干细胞株系的定向分化效率相差较大，不同多能干细胞株系建立方法和来源差异以及遗传和表观遗传背景差异，导致不同株系分化得到不同功能体细胞的体外分化效率相差很大，表现为不同干细胞株分化后得到的肝脏细胞在成熟标记物(如albumin白蛋白)表达水平和表达细胞比例相差较大。由于上述问题的存在，多能干细胞分化得到的肝脏细胞在基础科研和转化医学方面的应用受到较大限制。为进一步改善体外分化体系，提高所得肝脏细胞的质量，需要对体外分化体系进行针对性的改进。另一方面，体外培养的原代肝脏细胞(来源于人、鼠或其他模式动物肝脏组织)在培养较短时间内肝脏细胞特征会有大量丢失，表现为细胞形态变化，肝脏标示物(如albumin)表达水平等显著下降。为解决该问题，需要进一步改善原代肝脏细胞的体外培养体系，减缓原代肝脏细胞肝脏特征的丢失。目前用于改进肝脏细胞体外定向分化体系和原代细胞培养体系的方法主要有两种，第一种是通过调整生长因子或化合物的使用对体外分化体系或培养体系进行优化，该方法的缺陷在于使用的生长因子和化合物种类来源有限制，且往往价格较贵；第二种方法是优化体外二维培养体系，通过增加滋养层细胞或利用三维培养体系，对体外分化体系或培养体系进行优化，该方法的缺陷在于需要复杂的培养体系，体系的复杂程度高也导致可变因素増多、培养难度大且难以保证细胞培养的稳定性和安全性。
技术实现思路
本公开的目的是克服现有的肝脏细胞体外定向分化诱导技术和原代肝脏细胞体外培养技术中存在的上述缺陷，提供一种简便、高效的肝脏细胞体外定向分化及原代肝脏细胞体外培养技术。为达到以上目的，本公开的第一个方面提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途，其中，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养或原代肝脏细胞的体外培养。可选的，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为CI-994(Tacedinaline，CAS号：112522-64-2)、MS-275(Entinostat，CAS号：209783-80-2)、FK228(Romidepsin，CAS-号：128517-07-7)。可选的，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养，包括在诱导不成熟肝脏细胞向成熟肝脏细胞分化的培养基中添加浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。可选的，所述的用途包括以下步骤：(1)将多能干细胞在含有激活素A和/或P13K抑制剂的第一诱导培养基中培养获得内胚层细胞；(2)将所述内胚层细胞在含有骨形态发生蛋白4和/或成纤维生长因子2的第二诱导培养基中培养获得肝脏祖细胞；(3)将所述肝脏祖细胞在含有肝细胞生长因子的第三诱导培养基中培养获得不成熟肝脏细胞；(4)将所述不成熟肝脏细胞在含有5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及制瘤素M、肝细胞生长因子和地塞米松的第四诱导培养基中培养获得肝脏细胞。可选的，所述用途为原代肝脏细胞体外培养，包括在含有工作浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的原代肝脏细胞体外培养基中进行原代肝脏细胞体外培养。可选的，所述原代肝脏细胞体外培养基的组成成分包括：在基础原代肝脏培养基中添加5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本公开的第二个方面提供一种多能干细胞向肝脏细胞体外定向分化培养体系，其中，在诱导不成熟肝脏细胞向成熟肝脏细胞分化的培养基中添加浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为CI-994、MS-275或FK228。可选的，所述培养体系包括：第一诱导培养基：以RPMI-1640为基础培养基，添加0.8-1.2％的B27补充物、80-120ng/mL激活素A和4-6μM的P13K抑制剂；第二诱导培养基，以RPMI-1640为基础培养基，添加0.8-1.2％的B27补充物、16-24ng/mL的骨形态发生蛋白4、4-6ng/mL的成纤维生长因子2和0.4-0.6％二甲基亚砜；第三诱导培养基，以RPMI-1640为基础培养基，添加0.8-1.2％的B27补充物、16-24ng/mL肝细胞生长因子和0.4-0.6％二甲基亚砜；第四诱导培养基，以肝脏培养基为基础培养基，添加16-24ng/mL肝细胞生长因子、16-24ng/mL制瘤素M、80-120nM地塞米松、0.4-0.6％二甲基亚砜和5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本公开的第三个方面提供一种原代肝脏细胞体外培养基，其中所述培养基含有浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。可选的，所述培养基为以原代肝脏培养基为基础培养基添加浓度为5-10μmol/L的CI-994、MS-275或FK228。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor，HDACI)，简称HDACIs，是一类化合物，有干扰与组蛋白去乙酰化酶的功能。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通常可分为两大类：NAD+依赖性酶和Zn2+依赖性酶。Zn2+依赖性蛋白酶包括HDACsI、II、IV亚族；NAD+依赖性酶主要是HDACsIII亚族。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度，提高p21等基因的表达水平等途径，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化和(或)凋亡。本公开的专利技术人在对肝脏细胞体外定向分化培养的研究和原代肝脏细胞体外培养的研究过程中意外的发现，在培养体系中添加HDACI特别是4-乙酰氨基-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(CI-994)能显著促进分化所得到的肝脏细胞的质量和减缓原代肝脏细胞体外培养过程中肝脏特征的丢失。因此，利用本公开所提供的技术方案一方面可以促进多能干细胞向肝脏细胞的分化，获得分化程度均一、细胞特征保持良好的成熟干细胞；另一方面在原代肝脏细胞的体外培养过程中，能够帮助原代肝脏细胞在长时间体外培养后仍较好的保持其肝脏细胞特征。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是肝脏细胞成熟标记物白蛋白(albumin)细胞染色；图2是肝脏细胞成熟标记物白蛋白(albumin)分泌量和不成熟标记物甲胎蛋白(AFP)分泌量；图3是多种肝脏细胞成熟标记物mRNA表达水平；图4是本文档来自技高网...

【技术保护点】
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途，其特征在于，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养或原代肝脏细胞的体外培养。

【技术特征摘要】
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途，其特征在于，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养或原代肝脏细胞的体外培养。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为CI-994、MS-275或FK228。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述用途为多能干细胞向肝脏细胞的体外定向分化培养，包括在诱导不成熟肝脏细胞向成熟肝脏细胞分化的培养基中添加浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。4.根据权利要求3所述的用途，包括以下步骤：(1)将多能干细胞在含有激活素A和/或P13K抑制剂的第一诱导培养基中培养获得内胚层细胞；(2)将所述内胚层细胞在含有骨形态发生蛋白4和/或成纤维生长因子2的第二诱导培养基中培养获得肝脏祖细胞；(3)将所述肝脏祖细胞在含有肝细胞生长因子的第三诱导培养基中培养获得不成熟肝脏细胞；(4)将所述不成熟肝脏细胞在含有5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及制瘤素M、肝细胞生长因子和地塞米松的第四诱导培养基中培养获得肝脏细胞。5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述用途为原代肝脏细胞体外培养，包括在含有工作浓度为5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的原代肝脏细胞体外培养基中进行原代肝脏细胞体外培养。6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述原代肝脏细胞体外培养基的组成成分包括：在基础原代肝脏培养基中添加5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。7.一种多能...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈留芳，李程，茅永智，
申请(专利权)人：杭州观梓健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33