一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞及其制备方法和用途技术

本公开提供了一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将敲除载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述敲除载体的序列如SEQ ID NO.3所示；S2、将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S3、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并筛选出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的单克隆细胞株。本公开还提供了如上所述的制备方法制备得到的干细胞及其在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。通过上述技术方案，本公开提供了一种新的防治心血管疾病的方案，有效地降低了心血管疾病的发病率。

【技术实现步骤摘要】
一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞及其制备方法和用途
本公开涉及医药生物
，具体地，涉及一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
心血管疾病根据世界卫生组织的报道是全球的头号死因。2008年有约1730万人死于心血管疾病，预计到2030年，死于心血管疾病的人数将增至2330万人。目前被证明防治心血管疾病发病的最有效的方法是降低血脂含量，尤其是降低低密度胆固醇(LDL-C)含量。他汀类药物(statins)被有效的应用在心血管疾病的防治中，尽管如此，服用他汀类药物并不能完全防治心血管疾病：病人只会降低30～40％的发病率，并且有部分病人群体对他汀类药物治疗方案没有疗效反应。因此，亟需寻找新的治疗心血管疾病方案。
技术实现思路
本公开的目的是克服心血管疾病防治效果较差的缺陷，进一步降低心血管疾病的发病率。为了实现上述目的，本公开提供了一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将敲除载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述敲除载体的序列如SEQIDNO.3所示；S2、将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S3、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的单克隆细胞株。另一方面，本公开还提供了一种干细胞，该干细胞为如上所述的制备方法制备得到的干细胞。另一方面，本公开还提供了一种干细胞，该干细胞中的PCSK9基因和APOC3基因被定向敲除。再一方面，本公开还提供了一种干细胞在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途，所述干细胞为如上所述的制备方法制备得到的干细胞或如上所述的干细胞。通过上述技术方案，本专利技术在干细胞中将PCSK9基因和APOC3基因进行了双敲除，双敲除之后得到的干细胞通过注射的方式进入受试者后能够定植在肝脏中，并且有效地降低血液中甘油三酯和胆固醇水平，由此可以产生对心血管疾病的防治效果，从而提供了一种新的防治心血管疾病的方案，有效地降低了心血管疾病的发病率。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开提供了一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将敲除载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述敲除载体的序列如SEQIDNO.3所示；S2、将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S3、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的单克隆细胞株。本专利技术通过选择AAV病毒来将敲除载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和敲除载体共同通过CRISPR基因编辑来使得PCSK9基因和APOC3基因得以共敲除。其中，PCSK9基因是指NCBIGENEID为255738的基因；APOC3基因是指NCBIGENEID为345的基因。其中，优选地，步骤S2中，将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。在该优选情况下，能够进一步增加在干细胞中进行基因敲除的效率。其中，优选地，步骤S2中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为104-106。在该优选情况下，能够进一步增加在干细胞中进行基因敲除的效率。MOI值是感染时病毒与细胞数量的比值。其中，所述干细胞可以为间充质干细胞或诱导多能干细胞。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞。所述AAV病毒的血清型可以为AAV-1病毒、AAV-2病毒、AAV-3病毒、AAV-4病毒、AAV-5病毒、AAV-6病毒、AAV-7病毒、AAV-8病毒、AAV-9病毒、AAV-DJ病毒及AAV-DJ/8病毒，优选为AAV-8病毒、AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒，更优选所述AAV病毒的血清型为AAV9病毒，在该优选情况下，能够进一步增加在干细胞中进行基因敲除的效率。另一方面，本公开还提供了一种干细胞，该干细胞为如上所述的制备方法制备得到的干细胞。另一方面，本公开还提供了一种干细胞，该干细胞中的PCSK9基因和APOC3基因被定向敲除。其中，在PCSK9基因和APOC3基因二者都被定向敲除的情况下，干细胞能够获得同时降低甘油三酯和胆固醇的功能。再一方面，本公开还提供了一种干细胞在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途，所述干细胞为如上所述的制备方法制备得到的干细胞或如上所述的干细胞。其中，所述心血管疾病可以包括高脂血症、脑卒中、心肌梗死、冠心病、心绞痛和血栓中的至少一种。以下通过实施例进一步详细说明本专利技术：实施例1试剂来源：常规引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DMEM/F12培养基、DMEM培养基、Opti-MEM、Hyclone胎牛血清、胰酶购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；SpeI和HindIII限制性内切酶购于NEB(北京)有限公司；PrimerStar高保真DNA聚合酶购于宝生物工程(大连)有限公司；Benzonase、碘克沙醇购于默克化工技术(上海)有限公司；2×SYBRPCRmix购于东洋纺(上海)生物科技有限公司；Matrigel购于BDBiosciences(货号354277)。1、sgRNA设计以及合成(1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在APOC3基因ENST00000375345.3转录本3号外显子上设计靶向识别的APOC3sgRNA，优选结果如下：APOC3sgRNA:5’-cagtgcatccttggcggtcttgg-3’(SEQIDNO.1)。同时，针对PCSK9基因ENST00000302118.5转录本1号外显子上设计靶向识别的PCSK9sgRNA。优选结果如下：PCSK9sgRNA:5’-ggtgctagccttgcgttccgagg-3’(SEQIDNO.2)。其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。(2)该sgRNA由苏州吉玛基因股份有限公司合成并在该sgRNA序列的5’端和3’端末尾分的三个碱基的二号位和三号位上别添加O-Me、phosphorothioate的修饰。2、体外法检测sgRNA的活性(1)分别针对APOC3和PCSK9基因，从基因组扩增识别靶序列片段(APOC3:622bp；PCSK9:1027bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。APOC3-Test-FW:5’-tactccttctggcagacccagc-3’，(SEQIDNO.4)；APOC3-Test-REV:5’-ctgtcatctctcccgcagcag-3’，(SEQIDNO.5)；PCSK9-Test-FW:5’-gtctga本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将敲除载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述敲除载体的序列如SEQ ID NO.3所示；S2、将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4‑30小时的转染，得到转染后的培养物；S3、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的单克隆细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将敲除载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述敲除载体的序列如SEQIDNO.3所示；S2、将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S3、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S2中，将干细胞的悬液与所述待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为104-106。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李程，周海波，丁秋蓉，
申请(专利权)人：杭州观梓健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33