一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法技术

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明专利技术可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞的向成熟肝样细胞分化状态。

【技术实现步骤摘要】
一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSCs)作为一种新型基因治疗的靶细胞有着广泛的应用前景，其优势如下：(1)来源广泛，可从自体或异体获得，属于同种移植，不涉及伦理问题；(2)易于培养，具有增殖能力，体内外均保持多向分化潜能；(3)具有归巢组织损伤部位、分泌大量细胞因子的能力。但目前的研究发现，供体的个体差异、取材年龄的不同所造成的分化潜能的差异制约了间充质干细胞作为细胞移植药物的临床应用。在作为干细胞药物制备过程中，很难在体外诱导过程中判断分化为成熟肝样细胞的细胞比率、设置质控节点、实现实时监控、判别由于分化比率差异所造成的细胞制品间批次差异，从而限制了其作为细胞移植药物的临床应用。如何在体外传代扩增及分化过程中及时监测间充质干细胞的分化状态也成为干细胞工业质控中的难点和瓶颈。CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strandbreaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端链接(Non-homologousendjoining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同源重组(Homologydirectedrepair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大，整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基因敲入的报道。
技术实现思路
本公开的目的是实现对间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的实时检测，提供可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型以进行药物筛选。为了实现上述目的，本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述肝样细胞相关基因包括ALB和/或AFP；所述肝样细胞相关基因的敲入位点为所述肝样细胞相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述肝样细胞相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由肝样细胞相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本专利技术建立了一种可在间充质干细胞高效敲入长片段报告基因的方法，在不影响肝脏分化成熟标志物ALB基因和肝脏未成熟标准物AFP的基因表达的情况下，原位插入报告基因，由此可以构造了可在干细胞药物制备过程中，实时监测诱导分化的间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的分化成熟情况的细胞模型，可简便、快速、直观的检测间充质干细胞诱导向成熟肝样细胞分化的分化成熟情况，便于对间充质干细胞作为药物制备的整体过程进行质控、分析及质量判定，推动建立其工业化制备的标准，促进其临床转化。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述肝样细胞相关基因包括ALB和/或AFP；所述肝样细胞相关基因的敲入位点为所述肝样细胞相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述肝样细胞相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由肝样细胞相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。本专利技术通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒来将插入有荧光蛋白报告基因的同源重组载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。其中，所述肝样细胞相关基因是以NCBI数据库中的GeneSymbol来定义的，具体信息如表1所示，其对应的代表性sgRNA序列和左右同源臂序列也列于表1中。优选地，所述sgRNA如SEQIDNO.1或4所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQIDNO.2或5所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQIDNO.3或6所示。表1其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据肝样细胞相关基因的敲入位点设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。其中，可选地，将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。其中，可选地，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每106个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为1-50μmol；所述间充质干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×107个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。其中，可选地，步骤S3中，电转的条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述肝样细胞相关基因包括ALB和/或AFP；所述肝样细胞相关基因的敲入位点为所述肝样细胞相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述肝样细胞相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由肝样细胞相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1‑30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4‑30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述肝样细胞相关基因包括ALB和/或AFP；所述肝样细胞相关基因的敲入位点为所述肝样细胞相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述肝样细胞相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由肝样细胞相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：李程，严颖刚，丁秋蓉，
申请(专利权)人：杭州观梓健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33