一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法技术

本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的经化学修饰的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明专利技术建立了一种无需筛选标记，可显著提高大片段基因敲入干细胞效率的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法。
技术介绍
CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strandbreaks，DSBs)。DSBs可激活细胞内非同源末端链接(Non-homologousendjoining，NHEJ)和同源重组(Homologydirectedrepair，HDR)两种修复机制对DNA进行修复。在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，可引入碱基的随机插入或缺失，实现基因敲除。HDR则需要在外源基因模板存在的情况下，实现对基因组的精确修复。人多能干细胞因其具有多能性可成为体外不同类型的成体细胞和器官小体的潜在来源，其快速增殖能力使其可为科研分析及大规模药物筛选提供充足原材料。基因编辑技术在人多能干细胞中的应用对实现疾病模拟和推动再生医学的发展具有重要意义，已成为再生医学领域研究的热点。但在多能干细胞中，通过Cas9蛋白剪切实现HDR精准编辑基因组的效率极低，在多能干细胞中提高基因敲入效率成为亟待解决的关键技术问题。2014年Gonzalez研究组报道发现，通过在Cas9人多能干细胞中同时转入gRNA和ssDNA模板，可实现在人多能干细胞单个碱基基因敲入的效率达到10％。同年，另一研究组报道，在用诺考达唑(nocodazale)药物处理细胞使细胞处于M期之后，将Cas9核糖蛋白与ssDNA转染至人胚胎干细胞(hESCs)，基因敲入效率可达1.6％。2017年有研究发现，在CRISPR/Cas9体系下，使用单链脱氧寡核苷酸(ssODNs)作为模板，对10bp以下基因片段进行敲入人iPSC细胞株的效率可达45％。但由于ssODNs的大小与基因编辑效率存在负相关，Cas9/ssODN技术难以实现基因片段长度超过90bp的基因敲入。2017年专利技术的iCRISPR体系，在hESCs中对小片段基因敲入效率可达30％，但应用于大片段敲入效率则显著下降，只有1％不到的HDR整合率。另外，由于目前在多能干细胞中基因编辑效率低，通常需要通过筛选标记进行筛选来获得单克隆阳性细胞株，而筛选标记有可能会影响细胞功能，限制其在研究及临床上的应用。虽然通过piggyBac或Cre/loxP体系可以删除筛选标记，但Cre/loxP体系会将大片段的loxP序列滞留在基因组上，piggyBac体系则需要附近存在TTAA位点来防止其他外源序列的引入。
技术实现思路
本公开的目的是实现一种可显著提高大片段基因敲入干细胞效率的技术方案。为了实现上述目的，本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本专利技术建立了一种可显著提高大片段基因敲入人干细胞效率的技术方案，并可在敲入报告基因的情况下进一步建立无需筛选标记的可用于检测不同干细胞株敲入大片段基因效率的方法，通过此方法可检测不同干细胞株中不同基因位点的基因敲入效率，从而选择最佳的科研及临床应用方案。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。其中，电转是指DNA的电转化，又称作高压电穿孔法(high-voltageelectroproration，简称电穿孔法electroproration)，可用于将DNA导入细胞。本专利技术通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒来将插入有模板DNA的载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据待编辑的靶位点设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。其中，可选地，将针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。其中，可选地，步骤S3中，所述干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每106个所述干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为1-50μmol；所述干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×107个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为104-106。MOI值是感染时病毒与细胞数量的比值。其中，优选地，所述干细胞可以为胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞中的至少一种；优选所述干细胞为人诱导多能干细胞1016细胞株。所述AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV-DJ病毒，优选所述AAV病毒的血清型为AAV-DJ病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因敲入干细胞的效率。其中，所述模板DNA可以包括左同源臂序列、敲入片段和右同源臂序列；所述左同源臂序列和所述右同源臂序列共同决定了插入的精确位点，可以通过所述左同源臂序列和所述右同源臂序列来精确控制敲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1‑30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4‑30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团，优选所述化学修饰基团为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每106个所述干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为10-50μmol，所述干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×107个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李程，严颖刚，丁秋蓉，
申请(专利权)人：杭州观梓健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33