一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR124-3p制造技术

本发明专利技术公开了一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR124‑3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术将人类来源的tRNA作为运载骨架，从其碱基序列中的反密码子处，插入可表达成熟miR124‑3p的碱基序列，再通过质粒将该合成结构转运到普通的E.coli体内，经过12h左右的孵育，对目的重组型miRNA进行分离、纯化和脱盐处理，便可获得能直接使用的重组型miRNA。在保证高产率、高纯度的前提下，由于其从始至终的制备过程均是以自然界生物体为媒介，极高保真度的还原了天然miR124‑3p在细胞内原本的生物学特性，使其相对于人工化学合成的miRNA类似物而言，更加安全、稳定和天然。

【技术实现步骤摘要】
一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR124-3p
本专利技术属于基因工程
，涉及一种新型的可通过基因工程方法构建、规模化生产重组型的miR124-3p，即htRNALeu/miR124-3p。
技术介绍
骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是儿童和青少年中最常见的原发性肉瘤，男性发病率高于女性，比例约为2:1左右。从解剖学角度来讲，骨肉瘤最常见的发病部位常位于股骨远端、胫骨和肱骨的近端，且在所有患者中大约有50％至70％左右发生在膝关节周围。目前在临床上，对骨肉瘤主要的治疗手段为新辅助化疗---手术局部肿瘤组织切除---化疗药物维持的治疗方式，此治疗方案给临床患者的预后带来了巨大的改变，极大的降低了患者患肢的截肢比例，且明显的将患者五年生存率从之前的20％至30％左右提升至如今的70％以上。但是，这种治疗方式中通常所使用的化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂(或异环磷酰胺)剂量均相对较高，对人体的毒副作用极大，且随着治疗的不断推进，极易降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，甚至可直接对化疗药物产生耐药。因此，对于骨肉瘤患者及科研工作者而言，尽早研发出新型的骨肉瘤治疗药物和治疗方案就显得十分急迫。随着近年来人们对miR124-3p研究的不断深入，越来越多的实验证实，其在众多癌症如骨肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌以及淋巴系统肿瘤中的表达均低于正常水平。miR124-3p也可直接通过作用于其下游靶基因如MCT1、STAT3、p-STAT3和VAMP3等而调控相关的细胞信号通路，使肿瘤细胞得以被有效的控制。由ZhangC主持的一项研究表明，人骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞中转染miR124-3p类似物后，miR124-3p可通过调节ROR2蛋白而抑制其下游非传统型Wnt细胞信号通路的表达，进而抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭作用；HuangJ及其团队的研究显示，当通过转染的方式将miR124-3p递送至人骨肉瘤U2OS细胞之中后，miR124-3p可通过抑制细胞内Snail2蛋白的表达水平而明显抑制U2OS细胞的侵袭能力和增殖作用，并且将miR124-3p应用于荷瘤细胞小鼠体内后，小鼠的肿瘤大小及重量亦显著降低；MengQ等人最近有关miR124-3p的研究显示，在人骨肉瘤MG63细胞及临床骨肉瘤标本当中，miR124-3p可通过调控其下游靶基因TRAF6分子而抑制骨肉瘤细胞的细胞周期、细胞侵袭能力以及细胞增殖水平；ZhouY及其团队通过运用生物信息学方法预测分析得知，SPHK1是miR124-3p的潜在调节靶点，遂将miR124-3p转染至人骨肉瘤细胞中后，明显降低了骨肉瘤细胞中SPHK1分子及其相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平，从而显著抑制了骨肉瘤细胞的侵袭作用。随着人们对非编码RNA研究的不断深入及认识的不断加深，miRNA分子在新型的癌症治疗方案中所起到的重要作用也是越来越明显，通过参阅大量文献我们能够清楚的发现，目前不论是在实验室研究阶段还是在临床实践过程中，科研人员所运用的绝大多数miRNA均是通过人工化学合成而来，而利用其它方式获取的miRNA试剂却微乎其微，十分局限。众所周知，通过人工化学方式合成的miRNA要经过大量、特殊的人工基团修饰才能保证其结构和生物功能的稳定，但随着生产厂商将不同结构的人工化学基团添加至miRNA类似物之中后，这些人工基团本身所拥有的副作用也随之出现，且这些人工修饰基团具体能够对miRNA本身的生物学特性如miRNA的多维结构、理化性质、生物活性以及生物安全性等带来多大的影响和改变，目前也并没有合适的方法和有效的途径可以准确的检测和表述，因此，这些人工修饰的化学基团必定会在研究miRNA的过程中给科研工作者们带来不可忽视的影响。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种新型的可通过基因工程方法构建、规模化生产的重组型的miR124-3p，即htRNALeu/miR124-3p。该重组型的miR124-3p可高效表达出成熟的miR124-3p分子，并显著抑制骨肉瘤细胞的增殖及生长，有效的抑制小鼠原位骨肉瘤的生长及肺转移发生率。本专利技术另一目的，提供一种制备htRNALeu/miR124-3p的方法，以人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA作为骨架，保留其本生的DHU环和TΨC环等特殊的重要二级结构，然后将tRNA的反密码子区域用pre-miR34a的碱基序列代替，构建出新型的可表达非编码RNA的结构表达平台，即htRNA/pre-miR34a，再把miR124-3p的碱基序列嵌合在htRNA/pre-miR34a之中，将其结合至表达质粒里，接着再将该表达质粒转染到普通的E.coli体内进行孵育，利用苯酚法收集E.coli体内的总RNA，之后将所收集到的总RNA用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统以负离子交换的形式把htRNALeu/miR124-3p分离、纯化(纯度大于99％)，最后经过脱盐处理，遂可将其直接用于各类实验研究之中。该方法适用于大规模制备重组型miR124-3p，快速、廉价、高效、安全，具有良好的开发和应用前景。为实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种含有人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA的重组型的htRNALeu/miR124-3p，其核苷酸序列如下所示：ACCAGGAUGGCCGAGUGGUUAAGGCGUUGGACUGGCCAGCUGUGAGUGUUUCUUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCGGUGUUCCCGUCGUGCCUUCUAGAAGUGCUGCACGUUGUUGGCCCGAUCCAAUGGACAUAUGUCCGCGUGGGUUCGAACCCCACUCCUGGUACCA(SEQIDNO:1)。第二方面，提供上述htRNALeu/miR124-3p的制备方法，依次包括如下步骤：1)重组型htRNALeu/miR124-3p的设计及该基因PCR的扩增；2)可表达htRNALeu/miR124-3p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建和提取；3)将表达htRNALeu/miR124-3p的重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coliHST08体内；4)将步骤3)转染了质粒的E.coliHST08在培养基中大量增殖；5)对E.coliHST08总RNA进行提取，并将htRNALeu/miR124-3p纯化。优选地，步骤1)中所述的htRNALeu/miR124-3p的构建是通过RNA二级结构设计网站：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi所设计，tRNA为人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA，htRNALeu/miR124-3p的编码核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；为表达上述重组RNA，首先设计专属性PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG-3'(SEQIDNO:2)，下游引物序列为：5'本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有人类来源的以运载亮氨酸(Leu)的tRNA为运载骨架的重组型miR124‑3p，即htRNALeu/miR124‑3p，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种含有人类来源的以运载亮氨酸(Leu)的tRNA为运载骨架的重组型miR124-3p，即htRNALeu/miR124-3p，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种如权利要求1所述的重组型miR124-3p的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：1)重组型htRNALeu/miR124-3p的设计及该基因PCR的扩增；2)可表达htRNALeu/miR124-3p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建和提取；3)将表达htRNALeu/miR124-3p的重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coliHST08体内；4)将步骤3)转染了质粒的E.coliHST08在培养基中大量增殖；5)对E.coliHST08总RNA进行提取，并将htRNALeu/miR124-3p纯化。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的htRNALeu/miR124-3p的构建是通过RNA二级结构设计网站：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi所设计，tRNA为人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA，htRNALeu/miR124-3p的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；为表达上述重组RNA，首先设计专属性PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG-3'(SEQIDNO:2)，下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻爱喜，李鹏程，简超，
申请(专利权)人：武汉大学中南医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42