一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及其应用，本发明专利技术将小鼠Ctla4基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。本发明专利技术构建的CTLA4人源化动物模型不仅可用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人CTLA4抗体药物安全性评价的理想模型，对CTLA4抗体药物的毒理学进行临床前体内评价，填补了市场空白。

【技术实现步骤摘要】
一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及其应用
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰
，涉及基于CRISPR/Cas9技术的CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠或人鼠嵌合体来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。然而，通过临床前评估的候选药，大部分会在临床I期失败，小鼠与人体内生理、病理等的差异是重要的因素：人鼠免疫系统的差异、许多致病因子和药物在人鼠之间的种系特异性、药物靶点与受体在人鼠之间的亲和力差异、人源肿瘤与鼠源肿瘤的差异等都将影响临床前与临床数据的一致性。因此，构建具有人的功能性基因、细胞及组织的人源化小鼠模型具有重要的意义，可以随着人源化小鼠的不断完善，更好的反应预期临床数据。抗肿瘤免疫疗法在近两年掀起研究热潮，Checkpoint许多药物已获得了临床批准用药，并取得了可喜的成绩。抗癌热门靶点CTLA4是较PD1更早的免疫检查点，细胞毒T淋巴细胞抗原4(CytotoxicT-lymphocyteantigen-4，CTLA4/CD152)，是由CTLA4基因编码的一种白细胞分化抗原，属于免疫球蛋白超家族，是免疫系统中最重要的负调控因子。CTLA4与T细胞表面的协同刺激分子受体(CD28)具有高度的同源性，CTLA4胞外区能够与CD28竞争性的结合APC表面的B7分子配体(CD80/CD86)，产生抑制信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA4的免疫抑制效应可刺激免疫细胞大量活化增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。临床前数个小鼠动物模型显示阻断CTLA4后肿瘤的控制率提高。CTLA4抑制性单抗可以诱导免疫系统的持续激活，产生有效的抗肿瘤应答以及有限的自体免疫。目前有两种抗肿瘤效应机制：CTLA4抑制性单抗阻止CTLA4与B7受体的结合，CD28结合B7受体持续性的激活T细胞；去除肿瘤诱导的调节性T细胞(Treg)，Treg细胞持续性高水平表达CTLA4，可抑制肿瘤相关抗原的免疫反应，CTLA4抑制性单抗结合并抑制Treg细胞功能。CTLA4免疫检查点抑制剂突破了黑色素瘤的瓶颈，Ipilimumab(Yervoy)是靶向作用于CTLA4的全人源化单克隆抗体，于2011年被FDA批准治疗转移性黑色素瘤。临床前及临床试验结果表明，使用CTLA4抑制剂+PD1抑制剂的联合治疗时，黑色素瘤疗效高达75％(CTLA4抑制剂是30％，PD1是45％)。Ipilimumab在肺癌治疗中的临床试验中，与化疗药物紫杉醇/卡铂联合使用，用于NSCLC试验，毒副反应可很好的耐受。同时，目前有多个Ipilimumab联合其他免疫检查点或小分子化药等的临床正在推进，如Ipilimumab与PD-1抑制剂Opdivo(nivolumab)已合并用于黑色素瘤治疗。Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗先驱，开启了免疫治疗的先河。但同时，伴随着严重的临床毒副作用导致了临床试验的紧急叫停，Ipilimumab治疗的患者一半以上产生了3-4级严重的副作用，导致皮肤、垂体和肠道毒性反应，限制了抗人CTLA4抗体的研发与应用。尤其在免疫联合治疗的潮流下，Ipilimumab与其他靶点药物(如PD-1抗体Nivolumab)强强联合是未来的趋势，如何提高抗CTLA4抗体在肿瘤免疫治疗中的效果，并减少其诱发的免疫副作用，成一个亟待解决的课题。利用基因改造技术，将动物模型Ctla4基因的胞外区进行人源化，保留胞内区及跨膜区序列，构建人源化动物。以啮齿动物为例，小鼠CTLA4人源化后具有可直接进行人CTLA4抑制剂的评价、小鼠自身免疫系统不受影响、因小鼠近交系特点实验数据高重复性的特点。人源化小鼠的利用CTLA4人源化的动物小鼠模型，可以有效的评价抗人CTLA4抗体调动免疫系统对肿瘤的杀伤；模拟临床上Ipilimumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗人CTLA4抗体的安全性。因此，CTLA4人源化小鼠模型可以有效地推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证、免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。综上所述，建立一种CTLA4基因修饰人源化动物模型的构建方法非常必要。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法；可用于建立抗人CTLA4抗体临床前筛选的CTLA4人源化小鼠模型及药效评价平台。本专利技术的目的还在于提供一种CTLA4基因修饰人源化动物模型的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)确定CTLA4人源序列以及所述CTLA4人源序列在动物模型Ctla4基因中的替换区域；所述动物模型Ctla4基因的胞外区替换为所述CTLA4人源序列，而胞内区保留动物模型的原有序列；(2)在人源化替换区域设计并验证针对动物模型序列的sgRNA；(3)根据得到的sgRNA，设计并构建携带所述CTLA4人源序列的人源化打靶载体repairdonor；(4)将所述repairdonor及Cas9/sgRNA混合后，通过显微注射技术将混合样品转移至动物模型的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性动物模型体内，后代出生后，经两端PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0；对两端PCR鉴定阳性的F0动物进行测序验证，测序正确的动物模型为阳性；阳性F0与背景动物模型配繁获得F1，阳性F1互配后获得的纯合子即为所述CTLA4基因人源化动物模型。进一步地，所述CTLA4人源序列如SEQNo.1所示。进一步地，所述步骤(1)中，用所述CTLA4人源序列的Exon2替换动物模型Ctla4的Exon2，保留动物模型Ctla4信号肽、跨膜区及胞内区。进一步地，位于5’端靶位点和3’端靶位点的所述sgRNA的序列分别如SEQNo.3和SEQNo.4所示。进一步地，所述人源化打靶载体的序列如SEQNo.6所示。进一步地，所述F0代基因型鉴定：对获得的F0代动物基因组DNA分别使用两对引物进行repairdonor中靶后的两端PCR鉴定，引物000062-hCTLA4-5tF1(SEQNo.7)/000062-hCTLA4-5tR1(SEQNo.8)分别位于5’同源臂外及repairdonor的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在动物模型基因组5’进行了有效插入；000062-hCTLA4-3tF1(SEQNo.9)/000062-hCTLA4-3tR1(SEQNo.10)分别位于repairdonor的人源片段内及3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)确定CTLA4人源序列以及所述CTLA4人源序列在动物模型Ctla4基因中的替换区域；所述动物模型Ctla4基因的胞外区替换为所述CTLA4人源序列，而胞内区保留动物模型的原有序列；(2)在人源化替换区域设计并验证针对动物模型序列的sgRNA；(3)根据得到的sgRNA，设计并构建携带所述CTLA4人源序列的人源化打靶载体repair donor；(4)将所述repair donor及Cas9/sgRNA混合后，通过显微注射技术将混合样品转移至动物模型的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性动物模型体内，后代出生后，经两端PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0；对两端PCR鉴定阳性的F0动物进行测序验证，测序正确的动物模型为阳性；阳性F0与背景动物模型配繁获得F1，阳性F1互配后获得的纯合子即为所述CTLA4基因人源化动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)确定CTLA4人源序列以及所述CTLA4人源序列在动物模型Ctla4基因中的替换区域；所述动物模型Ctla4基因的胞外区替换为所述CTLA4人源序列，而胞内区保留动物模型的原有序列；(2)在人源化替换区域设计并验证针对动物模型序列的sgRNA；(3)根据得到的sgRNA，设计并构建携带所述CTLA4人源序列的人源化打靶载体repairdonor；(4)将所述repairdonor及Cas9/sgRNA混合后，通过显微注射技术将混合样品转移至动物模型的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性动物模型体内，后代出生后，经两端PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0；对两端PCR鉴定阳性的F0动物进行测序验证，测序正确的动物模型为阳性；阳性F0与背景动物模型配繁获得F1，阳性F1互配后获得的纯合子即为所述CTLA4基因人源化动物模型。2.如权利要求1所述的一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述CTLA4人源序列如SEQNo.1所示。3.如权利要求1所述的一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，用所述CTLA4人源序列的Exon2替换动物模型Ctla4的Exon2，保留动物模型Ctla4信号肽、跨膜区及胞内区。4.如权利要求1-3任意之一所述的一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，赵静，马秀英，张明坤，侯欢欢，高翔，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32