TOX基因及其sgRNA的应用制造技术

本发明专利技术公开了TOX基因及其sgRNA在制备抗肿瘤药物中的的应用，涉及T细胞分子生物领域；本发明专利技术通过在不同耗竭程度的CD8+T细胞中表达差异最显著的基因的发现、检测及其应用，通过高通量RNA测序，发现TOX在CD8+T细胞耗竭发生发展中具有重要调节作用，TOX表达与CD8+T细胞耗竭的发生、发展密切相关；再根据TOX的编码序列，设计合成sgRNA，通过与质粒载体接合，转化，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术CD8+T细胞中敲低TOX，能够显著减少CD8+T细胞耗竭的发生，显著恢复耗竭的CD8+T细胞的抗肿瘤能力，可应用于制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】
TOX基因及其sgRNA的应用
本专利技术涉及T细胞分子生物领域，具体而言，本专利技术具体涉及TOX基因及其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。
技术介绍
原发性肝癌，是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居于全球恶性肿瘤第五位，致死率列第三位，按病理学分型可分为肝细胞型、胆管细胞型和混合型三种，其中以肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)最为常见，占原发性肝癌90％以上(ChenW,etal.CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin2016；66:115-132.)。导致HCC的主要病因为慢性活动性肝炎，包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)导致的病毒性肝炎，酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝性肝炎。目前国内常见的肝细胞肝癌以HBV感染为主要途径。HCC以早期症状隐匿，复发率高及预后不佳为主要特点(LlovetJM,etal.Advancesintargetedtherapiesforhepatocellularcarcinomainthegenomicera.NatRevClinOncol2015；12:408-424；MiltiadousO,etal.ProgenitorcellmarkerspredictoutcomeofpatientswithhepatocellularcarcinomabeyondMilancriteriaundergoinglivertransplantation.JHepatol2015；63:1368-1377；ZhuAX,etal.HCCandangiogenesis:possibletargetsandfuturedirections.NatRevClinOncol2011；8:292-301.)。目前HCC的治疗方法主要包括外科手术治疗、放疗、介入治疗及化学治疗等方式。近年兴起的免疫治疗，通过调节机体的免疫系统，提高其对肿瘤细胞的杀伤能力以及改善肿瘤的免疫抑制状态来实现对抗肿瘤的目的，因为在多种恶性肿瘤治疗中的发挥了重要作用而备受关注，被称为肿瘤治疗最有前途的发展方向，其在HCC治疗中的应用也有相关的研究和报道(GretenTF,etal.CurrentconceptsofimmunebasedtreatmentsforpatientswithHCC:frombasicsciencetonoveltreatmentapproaches.Gut2015；64:842-848；PrietoJ,etal.Immunologicallandscapeandimmunotherapyofhepatocellularcarcinoma.NatRevGastroenterolHepatol2015；12:681-700)。免疫系统在慢性炎症向肿瘤的转化过程中扮演了极为重要而复杂的角色,肿瘤微环境中普遍存在一种特殊的T细胞功能紊乱现象，称为T细胞耗竭(Tcellexhaustion)。耗竭的T细胞主要呈现细胞活力、增殖能力及抗凋亡能力减弱，分泌效应细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF等)的能力及杀伤能力降低。在慢性炎症环境中，T细胞耗竭介导的低水平免疫状态，为肿瘤发生提供潜在可能，并且在肿瘤发生发展过程中，T细胞耗竭程度的加重逐渐导致抗肿瘤免疫减弱，从而使肿瘤免疫微环境变得更适宜肿瘤发展。耗竭T细胞在表面表达一系列免疫抑制性受体，如PD-1(programmedcelldeath-1)、CTLA-4(cytotoxicT-lymphocyteantigen-4)、LAG-3(lymphocyte-activationgene-3)、TIM-3(Tcellimmunoglobulinandmucin-domain-containingmolecule-3)、(KimPS,etal.FeaturesofrespondingTcellsincancerandchronicinfection.CurrOpinImmunol2010；22:223-230；HanahanD,etal.Hallmarksofcancer:thenextgeneration.Cell2011；144:646-674.)。T细胞耗竭，根据其程度分为可逆性的早期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平中等)，和不可逆的晚期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平很高)(WherryEJ,etal.MolecularandcellularinsightsintoTcellexhaustion.NatRevImmunol2015；15:486-499.)。针对早期耗竭的T细胞，给予阻断T细胞表面抑制分子的治疗，能够从一定程度上，恢复T细胞功能(WherryEJ,etal.MolecularandcellularinsightsintoTcellexhaustion.NatRevImmunol2015；15:486-499；FisicaroP,etal.AntiviralintrahepaticT-cellresponsescanberestoredbyblockingprogrammeddeath-1pathwayinchronichepatitisB.Gastroenterology2010；138:682-693,693e681-684；DayCL,etal.PD-1expressiononHIV-specificTcellsisassociatedwithT-cellexhaustionanddiseaseprogression.Nature2006；443:350-354；BarberDL,etal.RestoringfunctioninexhaustedCD8Tcellsduringchronicviralinfection.Nature2006；439:682-687.)。但是这种方法,只能够部分改善早期耗竭的T细胞的功能，并且对逆转晚期耗竭T细胞的状态几乎没有作用。这可能也就是临床治疗中，很多肿瘤病人对应用PD-1，CTLA-4等抗体治疗不敏感的重要原因，因而，针对不可逆的晚期T细胞耗竭的研究，开发针对性阻碍效应T细胞向晚期耗竭发展，以及恢复这种晚期耗竭T细胞的功能的新的高效抗肿瘤药物，已经成为本领域亟待解决的技术难题。目前对T细胞耗竭的机制研究，已发现了多个在T细胞耗竭发生中具有重要调控作用的分子，如PSGL-1，NFAT，Blimp-1，TNF，GSK3等等，提示了这些可以作为潜在的逆转T细胞耗竭的治疗靶点(TinocoR,etal.PSGL-1IsanImmuneCheckpointRegulatorthatPromotesTCellExhaustion.Immunity2016；44:1190-1203.14；TaylorA,etal.GlycogenSynthaseKinase3InactivationDrivesT-bet-MediatedDownregulationofCo-receptorPD-1toEnhanceCD8(+)CytolyticTCellResponses.Immunity2016；44:2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TOX基因在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.TOX基因在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指：根据TOX基因设计sgRNA，其核苷酸序列选自如SEQIDNO.3~SEQIDNO.7所示的任一种。3.一段RNA序列，其特征在于，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQIDNO.3~SEQIDNO.17的任一种。4.如权利要求3所述RNA在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。5.一种药物组合物，包含RNA序列以及药学上可以接...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓琛，孙倍成，沈彬，田文芳，张泽川，于伟伟，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32