一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种重组腺相关病毒载体，包含激活型的(constitutively active)人类Nrf2(Nrf2(CA))、CMV启动子/增强子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等，本发明专利技术还涉及上述重组腺相关病毒载体的制备方法，及上述重组腺相关病毒载体或包含上述重组腺相关病毒载体的组合物在制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。本发明专利技术的重组腺相关病毒载体能显著降低小鼠眼压，增加小鼠RGCs的存活率，有效的治疗青光眼视网膜神经节细胞病变。

【技术实现步骤摘要】
一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医学
，具体地说，是一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。
技术介绍
青光眼(glaucoma)是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压增高是其主要危险因素。目前已经认识到，青光眼属于一种神经变性性疾病，其病理特征是视网膜神经节细胞(retinalganglioncell,RGC)的凋亡及其轴突的变性，以及伴随而来的视功能进行性丧失。RGC负责向大脑输出由视网膜捕捉到的视觉信号，由于高眼压、多种遗传因素或神经退行性病变等引起的RGC持续变性或凋亡，可导致视神经乳头病变、视野缺失，进而发展为青光眼。青光眼病理机制复杂，有遗传和环境等因素参与，但其确切分子机制尚不明确。部分青光眼患者表现为高眼压，在临床可采取降眼压等对症治疗手段，但在长期无法逆转或延缓青光眼的发展。有研究发现，氧化应激损伤是青光眼高眼压损伤发生发展的一个重要病理机制，近年来研究认为Nrf2-ARE通路可能是RGCs细胞的重要抗氧化保护信号通路，RGCs细胞内Nrf2的表达受到复杂信号分子网络调控，包括Keap1、PI3K/AKT、P63、miRNA-141等。目前研究中被广泛肯定的是，在氧化应激环境下，Nrf2表达水平上调，并与Keap1亲和力下降，进而向细胞核内转移增加，与小maf形成二聚体，结合于调控抗氧化元件ARE，增加细胞内过氧化氢酶、SOD、硫氧还蛋白合成相关酶、GSH、HO-1、NQO-1等多种抗氧化分子，激活细胞抗氧化应激适应性反应，而且抑制氧化应激引起的炎症及自噬反应，保护RGCs细胞免受氧化损伤。Nrf2信号通路在正常RGC中处于静默状态，而轴突损伤后大部分RGC无法自主激活Nrf2通路而最终凋亡，有研究证实激活Nrf2通路可促进RGC在轴突损伤后存活，提示Nrf2通路对RGC在轴突损伤后存活很关键。因此，在各种视神经变性疾病中，增强RGC中Nrf2信号通路可能是防止RGC变性，促进RGC存活及轴突再生的有效治疗措施。腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。但重组腺相关病毒(rAAV)仍然存在一些不足，如重组病毒不稳定，病毒滴度低，接纳治疗基因的容量仍然有限(一般仅能插入的外源性基因片段最大约2000碱基对(bp)，否则rAAV的稳定性将被破坏)。因此，需要设计合理的重组腺相关病毒(rAAV)载体，以满足实际应用的需要。中国专利文献CN108379597A公开了一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物，所述基因载体包含显性抑制型(dominantnegative)人类Fas-associatedproteinwithdeathdomain(FADD-DN)、增强子/启动子、增加基因表达的β-globin内含子、humangrowthhormonepoly(A)tail序列等，还公开了上述基因载体或包含上述基因载体的组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用；其优点表现在：上述基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼等引起的视网膜神经节细胞病变。中国专利文献CN105087648B公开了一种携带MAGE-A3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用，该rAAV是在腺相关病毒载体中已经被删除的腺相关病毒结构基因位置处插入MAGE-A3抗原基因得到；该专利技术的rAAV可将其携带的MAGE-A3抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞，实验证明，被该专利技术的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制MAGE-A3抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。但是关于本专利技术中表达Nrf2蛋白的腺相关病毒载体及其制备方法与在治疗青光眼视网膜神经节细胞变性方面的应用，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种重组腺相关病毒载体。本专利技术的第二个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的制备方法。本专利技术的第三个目的是，提供一种药物组合物。本专利技术的第四个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的应用。本专利技术的第五个目的是，提供一种治疗青光眼的方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种重组腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列，Nrf2(CA)蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列选自与SEQIDNO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述增强子/启动子为CMV，选自与SEQIDNO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述增强子/启动子为CMV的序列如SEQIDNO:4所示。优选地，所述腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAVclone32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5。更优选地，所述腺相关病毒为AAV2。更优选地，所述腺相关病毒为单链AAV2。优选地，所述的重组腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQIDNO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。优选地，所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达Nrf2(CA)的基因序列、β-globin内含子、hGHpA(humangrowthhormonepoly(A)tail)、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。更优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示，所述L-ITR序列如SEQIDNO:3所示，所述CMV增强子/启动子序列SEQIDNO:4所示，所述β-globin内含子序列如SEQIDNO:5所示，所述hGHpA序列如SEQIDNO:7所示，所述R-ITR序列如SEQIDNO:8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的重组腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列，Nrf2(CA)蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的重组腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列，Nrf2(CA)蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述增强子/启动子为CMV。4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒为单链AAV2。5.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列、β-globin内含子、hGHpA、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示，L-ITR序列如SEQIDNO:3所示，CMV增强子/启动子序列如SEQIDNO:4所示，β-globin内含子序列如SEQIDNO:5所示，hGHpA序列如SEQIDNO:7所示，R-ITR序列如SEQIDNO:8所示，Ampicillin序列如SEQIDNO:9所示，f1ori序列如SEQIDNO:11所示。7.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学廷，孙晓东，高敏，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31