一种DF‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法技术

一种DF‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该细胞培养液每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10‑30 mg、柚皮素5‑15 mg、黄芪皂苷5‑15 mg、菟丝子提取物10‑20 mg、腐胺1‑10 mg和谷胱甘肽5‑20 mg。本发明专利技术具有以下有益效果：本发明专利技术所使用的DF‑1细胞培养液添加剂，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高DF‑1细胞生长速度；增强IBDV对DF‑1细胞的敏感性，提高了TCID50含量；由本发明专利技术所使用的DF‑1细胞培养液还可以大幅度提高鸡传染性法氏囊活疫苗免疫原性。

【技术实现步骤摘要】
一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法。
技术介绍
DF-1细胞来源于ELL鸡胚胎，是一种可传代的鸡成纤维细胞系，该细胞无禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，同时在形态上呈纤维状。DF-1细胞系还是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制、癌症研究等诸多领域，是生命科学领域重要的病毒转染、培养生物材料。在传统的DF-1细胞培养中，胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)一直被作为细胞培养基添加剂，但其在使用中存在诸多缺点：具有批间差异、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；价格昂贵，需要大量验证工作、使用不方便、货源紧张，来源不稳定等问题，还有随着来自动物保护组织的压力，因此，胎牛血清将逐步被无血清培养基取代，无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用。无血清培养基是以合成培养基为基础加入不同剂量的生长因子、结合蛋白、激素、低分子量营养物质（维生素、微量元素、脂类等），起到替代动物血清支持细胞正常生长代谢的作用。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术目的在于设计提供一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法的技术方案。所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10-30mg、柚皮素5-15mg、黄芪皂苷5-15mg、菟丝子提取物10-20mg、腐胺1-10mg和谷胱甘肽5-20mg。所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：红芪多糖15-25mg、柚皮素8-12mg、黄芪皂苷8-12mg、菟丝子提取物12-18mg、腐胺2-8mg和谷胱甘肽12-18mg。所述的一种DF-1细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量份的组分混合后，加入到盛有PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。所述的DF-1细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按照药物混合液：DMEM/F12重量比=1:1~1:2将两者充分混合后使用。本专利技术中中红芪多糖购买于：西安天瑞生物技术有限公司；柚皮素购买于：武汉易泰科技有限公司；黄芪皂苷购买于：海佰世凯化学科技有限公司；菟丝子提取物购买于：西安原生植物工程技术有限公司；腐胺购买于：Sigma；谷胱甘肽mg购买于：Sigma。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可替代血清，大幅度降低生产成本，保证了疫苗的质量和安全性。2、本专利技术所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可以大大提高细胞的生长速度。3、本专利技术所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可以促进鸡传染性法氏囊病毒对DF-1细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而提高鸡传染性法氏囊活疫苗的免疫原性。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。实施例1：培养液添加剂的制备红芪多糖：10mg（购买于：西安天瑞生物技术有限公司）柚皮素：5mg（购买于：武汉易泰科技有限公司）黄芪皂苷：5mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）菟丝子提取物:10mg（购买于：西安原生植物工程技术有限公司）腐胺：1mg（购买于：Sigma）谷胱甘肽:5mg（购买于：Sigma）将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:1制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。实施例2：培养液添加剂的制备红芪多糖：12mg（购买于：西安天瑞生物技术有限公司）柚皮素：8mg（购买于：武汉易泰科技有限公司）黄芪皂苷：6mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）菟丝子提取物:12mg（购买于：西安原生植物工程技术有限公司）腐胺：5mg（购买于：Sigma）谷胱甘肽：8mg（购买于：Sigma）将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:1.5制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。实施例3：培养液添加剂的制备红芪多糖：30mg（购买于：西安天瑞生物技术有限公司）柚皮素：15mg（购买于：武汉易泰科技有限公司）黄芪皂苷：15mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）菟丝子提取物：20mg（购买于：西安原生植物工程技术有限公司）腐胺：10mg（购买于：Sigma）谷胱甘肽:20mg（购买于：Sigma）将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:2制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。试验例1本专利技术培养液添加剂的应用1材料1.1DF-1细胞培养液添加剂按本专利技术实施例1-3制得1.2DMEM/F12基础培养基、胎牛血清购于GIBCO公司，硫乙醇酸盐培养基(TG)、胰酪蛋白胨培养基（TSB）购于北京中海生物科技有限公司1.3DF-1细胞购于ATCC，由浙江美保龙生物技术有限公司保存1.4鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株），购于中国兽医药品监察所1.5试验鸡14日龄SPF鸡60只，购于青岛易邦生物技术有限公司实验动物中心2方法2.1培养基检验2.1.1无菌检验将实施例1-3制备的DF-1细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行无菌检验，每个批次分别取1ml接种于2支50mlTG大管中，1支置于35-37℃培养，1支置于23-25℃培养，3d后各吸取培养物分别接种于10个TG小管，再分别置于35-37℃和23-25℃培养，另外每个批次分别取0.2ml接种于TSB小管内，置于23-25℃培养，同时做阴性对照，均培养7日，观察结果。2.1.2内毒素测定将实施例1-3制备的DF-1细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行内毒素检验，每个批次分别取1.7ml用鲎试剂盒分别进行检测，用酶标仪选择波长405nm测其OD值，同时做阴性对照。2.2细胞生长速度测定由实施例1-3使用的DF-1细胞培养液添加剂，以及含8%、10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液分别将已消化好的DF-1细胞，稀释成3*104个/ml的细胞密度接种于24孔培养板，每孔培养液体积为2mL，每种培养基接种1块24孔培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养2d后，用0.25%(w/v)的胰蛋白酶溶液消化用不同培养液培养的DF-1细胞细胞各4个培养孔，用CedexAS-20细胞密度和活力自动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DF‑1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10‑30 mg、柚皮素5‑15 mg、黄芪皂苷5‑15 mg、菟丝子提取物10‑20 mg、腐胺1‑10 mg和谷胱甘肽5‑20 mg。

【技术特征摘要】
1.一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10-30mg、柚皮素5-15mg、黄芪皂苷5-15mg、菟丝子提取物10-20mg、腐胺1-10mg和谷胱甘肽5-20mg。2.如权利要求1所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：红芪多糖15-25mg、柚皮素8-12mg、黄芪皂苷8-12mg、菟丝子提取物...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，张秀文，李阳，施杏芬，冷春青，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33