将干细胞分化为肝细胞谱系的方法技术

本公开提供了用于将干细胞分化为相关肝细胞谱系的方法和试剂盒，以及在筛选细胞反应、筛选表型和病况的治疗中使用所述相关肝细胞谱系的方法。在一个实施方案中，首先将干细胞分化为定形内胚层谱系细胞，通过一种或多种视黄酸活化剂和/或一种或多种转化生长因子‑β(TGFβ)抑制剂将所述定形内胚层谱系细胞分化为后前肠(PFG)谱系细胞。另一实施方案提供了用于通过一种或多种TGFβ信号传导活化剂、和/或一种或多种Wnt信号传导调节剂、和/或一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂将后前肠谱系细胞分化为肝芽祖细胞(LB)的方法；并且又一实施方案提供了用于通过一种或多种TGFβ信号传导抑制剂和/或成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂和/或一种或多种Notch抑制剂将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的方法。另一实施方案公开了通过一种或多种Notch抑制剂和/或糖皮质激素信号传导活化剂和/或一种或多种胰岛素信号传导活化剂和/或一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和/或另外的因子将肝祖细胞分化为肝细胞样细胞或静脉周肝细胞样细胞。还公开了用于维持LB处于自我更新状态、维持肝细胞样细胞处于静脉周或门静脉周状态的方法和试剂盒，以及用于LB和中肠/后肠(MHG)细胞的表面标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将干细胞分化为肝细胞谱系的方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年10月8日提交的新加坡申请号10201406436U的优先权的权益，该新加坡申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。
本专利技术大体上涉及生物
特别地，本专利技术涉及用于将定形内胚层的细胞分化为多个细胞谱系的方法。本专利技术进一步涉及用于进行如本文所述的方法的试剂盒和培养基。
技术介绍
终末期肝衰竭导致严重的临床症状，包括出血、脑病和最终死亡。值得注意的是，肝主要含有肝细胞，所述肝细胞执行对活生物体至关重要的各种各样的功能。这些功能包括消除血流中有害的有毒副产物，如酪氨酸代谢物和氨，以及分泌血清蛋白质，包括白蛋白和凝血因子。肝的发育和形态发生是一个复杂的过程。在早期胚胎发育期间，多能上胚层细胞在约E6.5形成前原条，其然后在约E7.5产生被称为内胚层胚层的细胞片。在E8.5，内胚层沿胚胎的前后轴延伸并闭合以形成肠管，最终产生沿着整个呼吸道和消化道的器官。在肠管形成期间，空间上不同的侧面和中间的内胚层祖细胞在中线会聚以形成后-前肠(PFG)和随后的肝芽(LB)，如通过小鼠胚胎中的命运作图研究所示。已对肝的早期发育进行了仪器研究，然而，对包括肝的特化、肝细胞的形成和肝功能的成熟在内的过程的理解仍然有限。例如，对诱导肝干细胞的形成以及它们的成熟后代的机制仍不清楚。此外，赋予肝细胞在体内植入、增殖和分化的能力的因素仍有待充分检查，其中仍然广泛经历获得成体样肝细胞的困难。总之，尽管多能干细胞可产生具有一定肝功能的肝细胞，但是对于这些肝细胞进展为成体样状态仍然存在明显未克服的障碍。此外，从这些多能干细胞产生可在成体肝中植入并稳健地重新入驻住(repopulate)的“真正的”且可移植的肝细胞样细胞仍具有挑战性。鉴于这些挑战，重要的是理解作为胚层的诱导和模式化以及分化为各种细胞谱系的多个步骤的基础的信号传导逻辑。特别地，重要的是理解调控肝特化的信号传导因子，并且使用基于人多能干细胞的分化构想出进行肝发生(hepatogenesis)的信号传导范式。本专利技术的目的是阐明干细胞诱导和分化的基础信号传导逻辑，以便单向地驱使干细胞产生具有最少外源谱系的肝细胞。
技术实现思路
根据一个方面，提供了将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠(PFG)谱系的方法，其包括使所述干细胞与：一种或多种视黄酸活化剂；和一种或多种TGFβ信号传导抑制剂接触。根据另一方面，提供了将后前肠谱系细胞分化为肝芽(LB)祖细胞的方法，其包括使所述后前肠谱系的所述细胞与：一种或多种TGFβ信号传导活化剂、一种或多种Wnt信号传导调节剂；和一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂接触。根据另一方面，提供了将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的方法，其包括使所述肝芽祖细胞与：一种或多种TGFβ信号传导抑制剂；一种或多种FGF信号传导抑制剂；和一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。根据另一方面，提供了将肝祖细胞分化为静脉周肝细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与：一种或多种Notch信号传导抑制剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂、一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和一种或多种TGFβ信号传导活化剂接触。根据另一方面，提供了将肝祖细胞分化为肝细胞样细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与：一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂；一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。根据另一方面，提供了维持肝芽祖细胞处于自我更新状态的方法，其包括使所述肝芽祖细胞与一种或多种FGF信号传导活化剂和一种或多种Wnt信号传导活化剂接触。根据另一方面，提供了维持肝细胞或肝细胞样细胞处于静脉周状态的方法，其包括使所述细胞与一种或多种Notch信号传导抑制剂和/或一种或多种Wnt信号传导活化剂接触。根据另一方面，提供了维持肝细胞处于门静脉周状态的方法，其包括使所述细胞与一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂接触。根据另一方面，提供了用于将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠谱系的试剂盒，其包含一种或多种视黄酸活化剂和一种或多种TGFβ信号传导抑制剂。根据另一方面，提供了用于将后前肠谱系细胞分化为肝芽祖细胞的试剂盒，其包含一种或多种TGFβ信号传导活化剂；一种或多种Wnt信号传导调节剂；和/或一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂。根据另一方面，提供了用于将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的试剂盒，其包含一种或多种TGFβ信号传导抑制剂；一种或多种FGF信号传导抑制剂；和/或一种或多种Notch信号传导抑制剂。根据另一方面，提供了用于将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的试剂盒，其包含一种或多种Notch信号传导抑制剂；抗坏血酸信号传导活化剂；一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂；和/或一种或多种胰岛素信号传导活化剂。根据另一方面，提供了用于将肝祖细胞分化为静脉周肝细胞样细胞的试剂盒，其包含一种或多种Notch信号传导抑制剂；一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂；一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂；和/或一种或多种TGFβ信号传导活化剂。根据另一方面，提供了用于将肝祖细胞分化为肝细胞或肝细胞样细胞的试剂盒，其包含一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂；一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂；一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂；和/或一种或多种Notch信号传导抑制剂。根据另一方面，提供了用于维持肝芽祖细胞处于自我更新状态的试剂盒，其包含以下因子中的一种或多种：一种或多种FGF信号传导活化剂和/或一种或多种Wnt信号传导活化剂。根据另一方面，提供了用于维持肝细胞或肝细胞样细胞处于静脉周状态的试剂盒，其包含以下因子中的一种或多种：一种或多种Notch信号传导抑制剂和/或一种或多种Wnt信号传导活化剂。根据另一方面，提供了用于维持肝细胞或肝细胞样细胞处于门静脉周状态的试剂盒，其包含一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂。根据另一方面，提供了选自EGFR或CD99的用于分离或选择LB细胞的表面标志物。根据另一方面，提供了用于分离或选择MHG细胞的表面标志物，其包括CD325(N-钙粘素)。根据另一方面，提供了筛选细胞反应的方法，所述方法包括：a)使根据如本文所述的方法产生的细胞群体与药理试剂接触；和b)针对由所述药理试剂诱导的细胞反应，评价所述细胞群体。根据另一方面，提供了筛选表型的方法，所述方法包括：a)向宿主动物施用根据如本文所述的方法产生的细胞群体，其中所述细胞群的细胞在至少一个遗传基因座中包含遗传修饰；和b)针对所施用的细胞群体诱导的可检测表型，评价所述宿主动物。根据另一方面，提供了治疗受试者的病况的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用治疗有效量的根据本文所述的方法产生的细胞，以便治疗所述受试者的所述病况。根据另一方面，提供了治疗有效量的根据如本文所述的方法产生的细胞在制造用于治疗受试者的病况的药物中的用途。具体实施方式定义本文所用的以下词语和术语应当具有所指示的含义：如本文所用的术语“干细胞”包括但不限于由它们在单细胞水平下自我更新并分化以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠谱系的方法，其包括使所述干细胞与一种或多种视黄酸活化剂；和/或一种或多种TGFβ信号传导抑制剂接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.08 SG 10201406436U1.一种将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠谱系的方法，其包括使所述干细胞与一种或多种视黄酸活化剂；和/或一种或多种TGFβ信号传导抑制剂接触。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述干细胞与一种或多种BMP信号传导活化剂接触。3.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其进一步包括使所述干细胞与一种或多种FGF信号传导活化剂接触。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述后前肠谱系细胞包括后前肠谱系标志物的升高的基因表达和背部前肠标志物的降低表达。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述方法的持续时间为约1到84小时。6.一种将后前肠谱系细胞分化为肝芽祖细胞的方法，其包括使所述后前肠谱系细胞与一种或多种TGFβ信号传导活化剂、一种或多种Wnt信号传导调节剂；和/或一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂接触。7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括使所述后前肠谱系细胞与一种或多种BMP信号传导活化剂接触。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝芽祖细胞包括肝芽祖细胞标志物的升高的基因表达和胰腺祖细胞标志物的降低表达。9.根据权利要求8所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝芽祖细胞包括包含AFP、TBX3、HNF4APROX1、HNF1B、HNF6、CEBPAα或其组合的标志物的升高的基因表达。10.根据权利要求6到9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导调节剂包括Wnt信号传导抑制剂和/或Wnt信号传导活化剂。11.根据权利要求10所述的方法，其中使所述Wnt信号传导抑制剂与所述后前肠谱系细胞接触约1到72小时的持续时间，随后使所述Wnt信号传导活化剂与所述后前肠谱系细胞接触约24到48小时的持续时间。12.根据权利要求6到11中任一项所述的方法，其中所述方法的持续时间为约1到120小时。13.根据权利要求6到12中任一项所述的方法，其中从根据权利要求1到5中任一项所述的方法获得所述后前肠谱系的所述细胞。14.一种将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的方法，其包括使所述肝芽祖细胞与一种或多种TGFβ信号传导抑制剂；一种或多种FGF信号传导抑制剂；和/或一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括使所述细胞与一种或多种Notch信号传导抑制剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂、一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂；和/或一种或多种胰岛素信号传导活化剂接触。16.根据权利要求14所述的方法，其中接触的持续时间为约48小时。17.根据权利要求15所述的方法，其中接触的持续时间为至少1到108小时。18.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括使所述肝芽祖细胞与一种或多种分化因子接触，所述分化因子选自包括以下的组：抗坏血酸信号传导活化剂；糖皮质激素信号传导活化剂；环AMP/PKA信号传导活化剂；胰岛素信号传导活化剂；制瘤素M信号传导活化剂；氨基酸混合物、和/或L-谷胱甘肽信号传导活化剂。19.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括使从权利要求14获得的细胞与一种或多种分化因子接触，所述分化因子选自包括以下的组：BMP信号传导活化剂；PKG信号传导抑制剂；糖皮质激素信号传导活化剂；磷脂前体；制瘤素M信号传导活化剂；氨基酸混合物、和L-谷胱甘肽信号传导活化剂。20.根据权利要求14到19中任一项所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝祖细胞包括肝标志物的升高的基因表达和胆标志物的降低表达。21.根据权利要求20所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝祖细胞包括包含白蛋白、c-MET、HNF4A、CEBPA或其组合的标志物的升高的基因表达。22.根据权利要求中14到21中任一项所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝祖细胞包括胆标志物SOX9的降低的基因表达。23.根据权利要求14到22中任一项所述的方法，其中由根据权利要求6到13中任一项所述的方法获得所述肝芽祖细胞。24.一种将肝祖细胞分化为静脉周肝细胞样细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与一种或多种Notch信号传导抑制剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂、一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和/或一种或多种TGFβ信号传导活化剂接触。25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种视黄酸信号传导活化剂接触。26.根据权利要求24或25所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种孕酮信号传导活化剂接触。27.根据权利要求24到26中任一项所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种维生素D信号传导活化剂接触。28.根据权利要求24到27中任一项所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种PKG信号传导活化剂接触。29.根据权利要求24到28中任一项所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述静脉周肝细胞样细胞包括静脉周肝细胞标志物的升高的基因表达和肝细胞样细胞标志物的降低表达。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述静脉周肝细胞标志物包含GS、CYP3A4、AAT、AXIN2或其组合。31.根据权利要求24到30中任一项所述的方法，其中所述方法的持续时间为约1到168小时。32.根据权利要求24到31中任一项所述的方法，其中由根据权利要求14到23中任一项所述的方法获得所述肝祖细胞。33.一种将肝祖细胞分化为肝细胞样细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂；一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和/或一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种Wnt信号传导调节剂接触。35.根据权利要求33或34所述的方法，其进一步包括使所述肝祖细胞与一种或多种PKG信号传导抑制剂接触。36.根据权利要求33到35中任一项所述的方法，其中相对于未分化细胞，所述肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪丽婷，罗凯明，林滨，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG