哺乳动物肺球体和肺球体细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及新的哺乳动物肺球体和肺球体细胞的发现及其应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】哺乳动物肺球体和肺球体细胞及其应用相关申请的交叉引用本申请要求Cheng等人在2014年9月18日、提交的美国临时申请号62/052,220的优先权，案卷号为127/90PROV。该申请公开的内容在此以引用的方式全部并入本文。
本专利技术涉及新的哺乳动物肺球体和肺球体细胞（LSCs）的发现及其用途。技术背景2.1介绍肺疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）和特发性肺纤维化（IPF），是破坏性的病症，根据世界卫生组织（WHO），为全球五大死亡原因之一。干细胞治疗是一种有前途的肺再生医学方法[2]。当前的临床前和临床中效果集中于输注分离自人骨髓、脂肪组织、胎盘组织或脐带血（称为间充质干细胞或作为骨髓基质细胞）的基质细胞，来治疗患有COPD、支气管肺发育不良、闭塞性细支气管炎、哮喘或急性肺损伤的病人[3-5，6，7]。多能细胞如胚胎干细胞或诱导多能干细胞具有巨大的分化和增殖潜力，但临床转化受到人类试验中潜在的致畸风险的阻碍[8-10]。另一方面，已经鉴定了多种驻留肺干细胞类型[11-16]。与间充质干细胞相比，这些作为临床使用的驻留肺干细胞的分离和扩增仍然是一个挑战。通常需要抗原分选和纯化。此外，尚未确定哪些表面标志物可鉴定出用于再生疗法的肺干细胞的最佳细胞来源。PCT公开号为WO2012/047951的专利（安特卫普等人）报道了对c-kit阳性的肺干细胞的发现及其用于治疗肺疾病或肺病症的用途。其他人已经报道了用于分离干细胞或其它细胞簇例如心血管细胞簇的方法。例如，美国专利号8,815,585（比亚兹莱等人）公开了用于胚胎干细胞（ESC）的自动化培养系统及胚胎干细胞在治疗中的用途。美国专利公开号2010/0061966（马奔等人），斯密斯等人2007年传播115期896-908页和穆希娜等人2004循环研究95期911-921页公开了制备心肌球样细胞团和衍生自心肌球样细胞团的细胞培养物的方法。这些心肌球样细胞团是具有心肌细胞的一些性状的细胞的自组装聚集体，例如在体外搏动的能力。它们公开了这些心肌球样细胞团用于治疗损伤的和患病的器官例如心脏等的用途。通过用含有添加的生长因子，特别是碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、心肌营养素-1和表皮生长因子（EGF）的培养基培养来制备心肌球样细胞团。
技术实现思路
根据世界卫生组织，肺部疾病是破坏性的病症，并被列为全球五大死亡原因之一。干细胞治疗是一个有前景的肺再生策略。以前的动物和临床研究已经集中在使用间充质干细胞（来自身体的其他部分）用于肺再生。本文主要公开一种从成年肺组织产生治疗性驻留肺祖细胞的快速而稳健的方法。来自成人肺组织的外生细胞在悬浮培养中自聚集形成三维的肺球体。没有抗原分选/纯化，肺球体在体外重现干细胞壁龛，并包含一种由肺干细胞和支持细胞组成的有用的新混合物。体外，肺球体细胞可以大量扩增，并显示出分化成肺泡结构和获得成熟肺上皮表型的潜力。在一并患有博莱霉素诱导的肺纤维化的严重免疫缺陷小鼠中，静脉内注射的人肺球体细胞抑制凋亡、纤维化和浸润，但促进血管生成。在肺纤维化的同基因大鼠模型中，在减少纤维化增生和浸润方面，肺球体细胞（LSCs）优于脂肪来源的间充质干细胞（MSC）。我们的数据表明肺球体是一种简单的生产治疗肺部疾病所需再生肺细胞的方法。在具体的非限制性实施方案中，本专利技术提供了制备治疗上有用的哺乳动物肺球体的方法，其包括（i）在贴壁培养条件下培养人肺组织外植体细胞以形成第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养第一肺细胞生长培养物以形成肺球体簇；和（iii）收集治疗上有用的哺乳动物肺球体。本专利技术还提供了制备治疗上有用的哺乳动物肺球体细胞的方法，其包括（i）在贴壁培养条件下培养人肺组织外植体细胞以形成第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养第一肺细胞产物培养物以形成肺球体；和（iii）在贴壁培养条件下培养肺球体，以形成治疗上有用的哺乳动物肺球体细胞。本专利技术提供了治疗方法。例如，其提供了用于治疗哺乳动物患者的肺部疾病的方法，其包括向患者提供有效治疗量的哺乳动物肺球体，其中肺球体通过如下方式获得（i）在贴壁培养条件下培养哺乳动物肺组织外植体以形成第一肺细胞生长培养物；和（ii）在低粘附条件下培养第一肺细胞生长培养物以形成肺球体。一种治疗哺乳动物患者肺部疾病的方法，包括给患者提供有效治疗量的哺乳动物肺球体细胞，其中肺球体细胞通过如下方式获得：（i）在贴壁培养条件下培养哺乳动物肺组织外植体，形成第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养第一肺细胞生长培养物以形成肺球体；和（iii）在贴壁培养条件下培养肺球状体簇，以形成治疗上有用的哺乳动物肺球体细胞。一种包含从哺乳动物肺组织制备的哺乳动物肺球体的药物组合物，其中（a）肺球体具有约25μM至约500μM的直径；（b）（i）对于c-Kit是阴性或弱阳性；（ii）至少对一种造血标记物呈阴性;和（iii）至少对一种心肌球样细胞团标记物呈阴性；和（c）药学上可接受的载体。一种包含由哺乳动物肺组织制备的哺乳动物肺球体细胞的药物组合物，其中（a）对于（i）c-Kit是弱阳性或阴性的；（ii）至少一种造血标记物阴性；和（iii）对于至少一种心肌球样细胞团标记物为阴性；和（b）药学上可接受的载体。在上述方法或组合物中，哺乳动物肺球体或肺球体细胞可以是人肺球体或人肺球体细胞。步骤（i）中的贴壁培养条件可以是糖蛋白包被的，蛋白质包被的或蛋白聚糖包被的表面，例如胶原蛋白包被的表面，纤连蛋白包被的表面，层粘连蛋白包被的表面或未包被的塑料表面。低粘附条件包括生物反应器或中性电荷水凝胶包被的表面或任何抗细胞附着的表面。在一个实施方案中，哺乳动物肺球体或肺球体细胞可以是（i）对CCSP、CD105、CD90和Pro-SPC的抗体是阳性的；和（ii）对造血标记物的抗体是阴性的。在一个实施方案中，通过细胞流式细胞术显示LSCs对以下百分比的标志物呈阳性：CD105：50-100％、CD90：0-100％、Pro-SPC：5-100％、CCSP：5-100％。在另一个实施方案中，LSCs是CD105：50-75％、CD90：0-50％；Pro-SPC：5-50％；CCSP：5-50％。在另一个实施方案中，LSCs是CD105：75-100％、CD90：50-100％、Pro-SPC：50-100％、CCSP：50-100％。在一个实施方案中，培养条件可包括由伊斯科夫改良的杜贝尔的培养基（IMDM）和胎牛血清（FBS）组成的培养基。本专利技术还提供了一种药物组合物，其包含根据段落[0007、008、0013-1016]中任一段所定义的方法获得的肺球体或肺球体细胞，浓度为90-250×103个细胞/ml，优选100-120×103个细胞/ml作为活性成分，以及药理学上可接受的佐剂和/或赋形剂，所述组合物配制用于静脉内注射。在治疗方法中，哺乳动物患者可以是人类患者或兽医患者。治疗可以是同种异体治疗，自体治疗或异种治疗。肺部疾病可以是慢性肺部疾病或急性肺部疾病。慢性肺疾病的非限制性实例包括哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、囊性纤维化、肺气肿、肺癌和肺纤维化。急性肺部疾病的非限制性实例包括细菌性肺炎、闭塞性细支气管炎组织性肺炎（BOOP）、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用以制备治疗上有用的哺乳动物肺球体的方法，其包含以下步骤：（i）在贴壁培养条件下培养哺乳动物肺组织外植体细胞以形成一个第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养所述第一肺细胞外向生长培养物以形成肺球体簇；（iii）收集在治疗上有用的哺乳动物肺球体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.18 US 62/052,2201.一种用以制备治疗上有用的哺乳动物肺球体的方法，其包含以下步骤：（i）在贴壁培养条件下培养哺乳动物肺组织外植体细胞以形成一个第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养所述第一肺细胞外向生长培养物以形成肺球体簇；（iii）收集在治疗上有用的哺乳动物肺球体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体是人肺球体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（i）中所述贴壁培养条件是糖蛋白包被的、蛋白质包被的或蛋白聚糖包被的表面。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白包被的表面是胶原包被的表面、纤连蛋白包被的表面或层粘连蛋白包被的表面。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（i）中所述贴壁培养条件是未被包被的塑料表面。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低粘附条件包括一个生物反应器或中性电荷水凝胶涂覆的表面。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体：（i）对CCSP，CD105，CD90和Pro-SPC的抗体呈阳性；（ii）对CD31，CD34和CD45的抗体呈阴性。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养条件包括由伊斯科夫改良的杜贝尔的培养基（IMDM）和胎牛血清（FBS）组成的培养基。9.一种制备治疗上有用的哺乳动物肺球体细胞的方法，包含以下步骤：（i）在贴壁培养条件下培养人肺组织外植体细胞以形成第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养所述第一肺细胞生长培养物以形成肺球体；（iii）在贴壁培养条件下培养所述肺球体，以形成治疗上有用的哺乳动物肺球体细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体细胞是人肺球体细胞。11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（i）中所述贴壁培养条件是糖蛋白包被的、蛋白质包被的或蛋白聚糖包被的表面。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白包被的表面是胶原包被的表面、纤连蛋白包被的表面或层粘连蛋白包被的表面。13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（i）中的所述贴壁培养条件是未被包被的塑料表面。14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述低粘附条件包含一个生物反应器或中性电荷的水凝胶涂覆的表面。15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体细胞：（i）对CCSP，CD105，CD90和Pro-SPC的抗体呈阳性；（ii）对CD31，CD34和CD45的抗体呈阴性。16.一种治疗哺乳动物患者的肺部疾病的方法，其包含向所述患者提供有效治疗量的哺乳动物肺球体，其中所述肺球体通过如下步骤制备：（i）在贴壁培养条件下培养哺乳动物肺组织外植体以形成第一肺细胞生长培养物；（ii）在低粘附条件下培养所述第一肺细胞生长培养物以形成肺球体。17.根据权利要求16的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体是人肺球体。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物患者是人类患者。19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物患者是兽医患者。20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体被用于同种异体移植治疗。21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球体被用于自体移植治疗。22.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物肺球...

【专利技术属性】
技术研发人员：程珂，艾瑞克·T·亨瑞，约翰·科斯，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学，
类型：发明
国别省市：美国,US