携带兔化猪瘟弱毒株病毒的ST细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术为携带兔化猪瘟弱毒株病毒的ST细胞株及其应用，公开了一株携带猪瘟弱毒株的猪胎睾丸传代细胞株及其应用。该细胞携带猪瘟病毒，能稳定传代并可大量产生病毒，制备的病毒可用于预防和治疗猪瘟病；本发明专利技术生产猪瘟病毒的流程简单，生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
携带兔化猪瘟弱毒株病毒的ST细胞株及其应用专利技术所属领域：本专利技术属于细胞工程与病毒培养
，具体地说，本专利技术涉及可与兔化猪瘟弱毒株共培养的ST细胞株，大量培养制备兔化猪瘟弱毒株的方法及应用。
技术介绍
：利用ST细胞生产猪瘟病毒是最常用的猪瘟病毒生产技术，以此为基础生产猪瘟病毒弱毒疫苗为当前国内猪瘟疫苗生产的主要工艺。本生产技术具工艺流程比较简单，有病毒效价较高，产品质量比较稳定等优点。然而，随着市场对本产品的需求量越来越高，对产品品质要求也越来越高，以及生产厂家对生产成本的要求越来越高，本生产工艺有必要进行进一步的优化。常用于猪瘟病毒培养的工艺如下：1、制备ST细胞，培养48小时；2、去培养液，接种猪瘟病毒，添加含小牛血清2%的维持液；3、培养96小时后，收集上清；4、对上清液进行离心，收集上清液即为病毒液。本技术存在几个重要的问题：1、一个培养容器里的ST细胞来源可能差别很大，对病毒的敏感性及生产猪瘟病毒能力差别很大，不能稳定、高效地生产猪瘟病毒；2、每一批细胞都需要重新接种病毒，接种效率不稳定，而且，工艺比较复杂。因此，需要更高效率的培养方法和更简单的生产工艺来取代目前这一工艺。专利技术
技术实现思路
：本专利技术的一个目的是提供一种能稳定持续扩增兔化猪瘟弱毒株病毒的细胞株，该细胞携带兔化猪瘟弱毒株病毒，能大规模产生兔化猪瘟弱毒株病毒，病毒效价能达到107以上。本专利技术的另一个目的是提供一种大量扩增兔化猪瘟弱毒株病毒的方法。本专利技术的再一个目的是提供新的细胞株在培养兔化猪瘟弱毒株病毒中的应用。本专利技术的再一个目的是提供新的细胞株在制备猪瘟病毒疫苗中的应用。本专利技术公开了一株携带兔化猪瘟弱毒株的ST细胞株，其特征在于，该细胞是ST细胞经兔化猪瘟弱毒株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，并稳定持续产毒，该细胞是PGcsfv-ST细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016217，保藏日期是2016年12月22日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学。PGcsfv-ST细胞株是将兔化猪瘟弱毒株感染猪胎睾丸传代细胞系筛选获得，该细胞具有稳定培养的生长特征；进入对数生长期后，更换维持液继续培养可稳定持续产生兔化猪瘟弱毒病毒；病毒效价达到107以上。本专利技术公开了制备并筛选PGcsfv-ST细胞株的方法，该方法包括下列步骤：1）细胞制备：复苏的ST细胞采用含小牛血清10%的DMEM培养基传代3代以上。2）病毒感染液的配制：取经RID50测定效价在2万倍-8万倍的猪瘟病毒弱毒株的兔脾淋毒冻干粉，按照2克/1000毫升的比例与细胞维持液混合均匀制成。3）病毒接种：吸出细胞培养容器中的培养上清液，然后注入与上清液等体积的病毒液。4）传代：采用常规的方法将携带猪瘟病毒的ST细胞进行传代，连续传代5代以上。5）病毒滴度检测：采用实时定量PCR的方法检测猪瘟病毒培养液上清中的猪瘟病毒含量。6）细胞计数：制备动物细胞悬液，进行计数板计数；7）单克隆筛选：根据细胞计数结果，每个25ml克氏瓶细胞采用10ml培养液稀释，取其中40μl细胞培养液，运用1:5倍比稀释的方法，直至稀释到56倍，终末浓度达到每孔一个细胞，然后培养至每个单细胞团含10-30个细胞，以1:1传至新的96孔板。待长满后，1:2传至新的细胞培养板，其中，一块板上细胞用来检测猪瘟病毒产量，一块板用来继续传代。8）带毒量分析：对不同的细胞孔，各取1μl培养液上清，采用实时定量PCR的方法进行病毒含量测定。选其中产量最高的10个细胞孔，继续传代，且连续检测5代，保留其中毒价最高且稳定的细胞株。9）待96孔板孔内细胞长满后，将ST细胞按1（96孔板）：1（24孔板）传代。待24孔板上细胞长满后，以1（24孔板）：1（6孔板）传代。待6孔板细胞长满后，一个细胞孔传代一个25cm2克氏瓶。10）带毒细胞株传代：细胞在培养容器内生长至70-80%进行细胞传代，传代比例为1:2-1:4。11）带毒细胞的建库：每传代五代，冻存细胞一批，采用含45%小牛血清和10%的二甲亚砜的DMEM培养基冻存。持续传代至50代以上。本专利技术人将克隆筛选的一株PGcsfv-ST细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016217。保藏日期是2016年12月22日。本专利技术还公开了利用PGcsfv-ST细胞株培养兔化猪瘟弱毒毒株的方法，该方法包括如下步骤：1)用常规方法接种培养PGcsfv-ST细胞株，48小时至对数生长期，细胞长满单层；2)传代细胞培养48小时后，更换为含血清为2%的维持液进行培养；3)维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；4)原贴壁细胞继续加入维持液培养，维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；；5)重复步骤3，4，获得大量病毒液。本专利技术还公开了利用PGcsfv-ST细胞株制备猪瘟病毒疫苗的方法，该方法包括如下步骤：1)用常规方法接种培养PGcsfv-ST细胞株，48小时至对数生长期，细胞长满单层；2)传代细胞培养48小时后，更换为含血清为2%的维持液进行培养；3)维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；4)原贴壁细胞继续加入维持液培养，维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；；5)重复步骤3，4，获得大量病毒液；6)病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按1:1的比例混合，分装，进行冻干，成为猪瘟弱毒冻干疫苗。本专利技术还公开了PGcsfv-ST细胞株在培养兔化猪瘟弱毒毒株中的应用。本专利技术还公开了PGcsfv-ST细胞株在制备猪瘟病毒疫苗中的应用。。本专利技术的优点：于现有技术相比，本专利技术有如下优点：本专利技术提供的携带猪瘟病毒高产毒ST细胞系能够生产高效价的猪瘟病毒,其病毒效价能高达107；本专利技术提供的携带猪瘟病毒高产毒ST细胞系能稳定携带猪瘟病毒，无需进行病毒接种，生产猪瘟病毒的流程比较简单，成本比较低；附图说明图1是携带猪瘟病毒高产毒ST细胞系显微镜观测图图2携带猪瘟病毒高产毒ST细胞系荧光抗体中和实验图具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不能限制本专利技术的保护范围。实施例1生物材料来源，及培养基猪胎睾丸传代细胞系来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCGDC007，研究者可从CCTCC购买兔化猪瘟弱毒毒株来源于武汉中博生物股份有限公司猪瘟疫苗生产用毒株,研究者可从市场兽医店购买，也可直接购买中博生物股份有限公司生产猪瘟疫苗。PGcsfv-ST细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016217，保藏日2016年12月22日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学。培养基高糖DMEM+10%FBS,维持液高糖DMEM+2%FBS实施例2：建立高产猪瘟病毒弱毒且可永续性带毒传代的ST细胞系（1）细胞制备：复苏的ST细胞采用含小牛血清10%的DMEM培养基传代3代以上。（2）病毒感染液的配制：取经RID50测定效价在2万倍的猪瘟病毒弱毒株的兔脾淋毒冻干粉，按照2克/1000毫升的比例本文档来自技高网...

【技术保护点】
携带兔化猪瘟弱毒株的ST细胞株，其特征在于，该细胞是ST细胞经兔化猪瘟弱毒株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，并稳定持续产毒，该细胞是PGcsfv‑ST细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016217。

【技术特征摘要】
1.携带兔化猪瘟弱毒株的ST细胞株，其特征在于，该细胞是ST细胞经兔化猪瘟弱毒株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，并稳定持续产毒，该细胞是PGcsfv-ST细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016217。2.根据权利要求1所述的细胞株培养兔化猪瘟弱毒毒株的方法，该方法包括如下步骤：1）用常规方法接种培养PGcsfv-ST细胞株，48小时至对数生长期，细胞长满单层；2）传代细胞培养48小时后，更换为含血清为2%的维持液进行培养；3）维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；4）原贴壁细胞继续加入维持液培养，维持培养72-96小时收集上清液，过滤，获得病毒液，测定病毒效价，效价达到107为合格；5）重复步骤3，4，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭霞，高其双，夏瑜，桑奥文，谭珺隽，程百炼，周刚，卢顺，王利燕，雷长宁，
申请(专利权)人：武汉市工程科学技术研究院，武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42