一种MDBK细胞培养液及其制备方法、使用方法技术

一种MDBK细胞培养液及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该细胞培养液每1000ml 去离子水中含有以下组分：DMEM粉末、转铁蛋白储液、bFGF储液、EGF储液、IL‑3、蜂胶黄酮、黄芪皂苷、青霉素、链霉素。本发明专利技术具有以下有益效果：本发明专利技术所使用的MDBK细胞培养液，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高MDBK细胞生长速度；增强BVDV对MDBK细胞的敏感性，提高了病毒含量；由本发明专利技术所使用的MDBK细胞培养液还可以大幅度提高BVD‑MD灭活疫苗的免疫原性。

MDBK cell culture liquid, preparation method and using method thereof

The invention relates to a MDBK cell culture solution, a preparation method and a use method thereof, belonging to the technical field of veterinary biological products. The cell culture medium per 1000ml deionized water containing the following components: DMEM powder, transferrin liquid storage, liquid storage, bFGF EGF, IL 3, liquid propolis flavone, astragalus saponin, penicillin and streptomycin. The invention has the following advantages: the invention of the MDBK cell culture medium, greatly reduced the amount of serum, reduce the cost of cell culture; increase the growth rate of MDBK cells; enhance the sensitivity of BVDV to MDBK cells, improve the content of virus; immunogenicity used by the invention of the MDBK cell culture medium it can greatly improve the BVD MD inactivated vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种MDBK细胞培养液及其制备方法、使用方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种MDBK细胞培养液及其制备方法、使用方法。
技术介绍
MDBK细胞为胎牛肾细胞，可连续传代培养，此细胞主要用于病毒的培养，特别是牛病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）对此细胞尤为敏感。牛病毒性腹泻/粘膜病毒病（BVD-MD）是由牛病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）引起的一种牛的急性、热性传染病，其临诊特征为粘膜发炎、糜烂、坏死、腹泻以及怀孕母牛流产，目前我国已将该病列为三类疫病。目前控制BVD-MD的主要方法是使用疫苗进行免疫防控，疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程，BVD-MD疫苗通常是大规模培养细胞收获病毒液，但目前多采用含血清的培养液培养细胞，血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。由使用血清所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。无血清培养液具有诸多优势：简化下游目的产物的分离纯化、节约成本；避免血清批次间的差异性，提高细胞培养的稳定性及结果的可靠性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；无血清培养液由于添加成分相对确定，可用于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术目的在于设计提供一种MDBK细胞培养液及其制备方法、使用方法的技术方案。所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于每1000ml去离子水中含有以下组分：DMEM粉末9-12g、转铁蛋白储液1-3ml、bFGF储液0.8-4ml、EGF储液0.8-4ml、IL-31-10ug、蜂胶黄酮2-30mg、黄芪皂苷20-60mg、青霉素5-10万单位、链霉素5-10mg。所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于每1000ml去离子水中含有以下组分：DMEM粉末10-12g、转铁蛋白储液1.2-2.6ml、bFGF储液1.2-2ml、EGF储液1.2-2ml、IL-32-8ug、蜂胶黄酮6-25mg、黄芪皂苷30-50mg、青霉素6-8万单位、链霉素6-8mg。所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于所述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于所述的bFGF、EGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油分别溶解bFGF、EGF，分别配成浓度为50ug/ml、30ug/ml的储液，置于-20℃备用。所述的一种MDBK细胞培养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用；2）以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油分别溶解bFGF、EGF，分别配成浓度为50ug/ml、30ug/ml的储液，置于-20℃备用；3）取所述配方量的组分，加入到去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。所述的一种MDBK细胞培养液的使用方法，其特征在于包括以下步骤：在2.5L生物反应器中加入200-500mlMDBK细胞培养液，用浓度为8.8%的碳酸氢钠调整培养液的PH为7.0-7.4，按2×105-5×105个/ml初始细胞密度接种，以800-1200r/min的搅拌速度进行搅拌，置于37℃下培养72-80h，按1:3-1:5进行传代培养，依此法传代培养至10-15代，即可获得可以进行稳定悬浮培养的MDBK细胞。所述的一种MDBK细胞培养液的使用方法，其特征在于将BVDV病毒液接入到稳定悬浮培养的MDBK细胞中，以800-1200r/min的搅拌速度进行悬浮培养，置于37℃下培养48-56h后，待细胞病变达到75%以上进行收获病毒液。本专利技术中各组分均为现有产品，其中DMEM粉末、转铁蛋白、bFGF、EGF、青霉素、链霉素和IL-3购买于Sigma；蜂胶黄酮购买于陕西森弗天然制品有限公司；黄芪皂苷购买于上海佰世凯化学科技有限公司。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术所制备的MDBK细胞培养液，为无添加血清培养液，既可以大幅度降低生产成本，又保证了疫苗的质量和安全性。2、本专利技术所制备的MDBK细胞培养液，还可以大大提高细胞的生长速度。3、本专利技术所制备的MDBK细胞培养液，可以提高BVDV对MDBK细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而还提高BVD-MD灭活疫苗的免疫原性。4、本专利技术所制备的MDBK细胞培养液，提高了MDBK细胞、BVDV对悬浮培养的适应性，从而提高病毒的繁殖效率。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。实施例1：培养液的制备DMEM粉末：9g(购买于：Sigma)转铁蛋白储液：1ml(转铁蛋白购买于：Sigma)bFGF储液:0.8ml(bFGF购买于：Sigma)EGF储液:0.8ml(EGF购买于：Sigma)IL-3：1ug(购买于：Sigma)蜂胶黄酮：2mg（购买于：陕西森弗天然制品有限公司）黄芪皂苷：20mg（购买于：上海佰世凯化学科技有限公司）青霉素：5万单位(购买于：Sigma)链霉素：5mg(购买于：Sigma)上述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。上述的bFGF、EGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油分别溶解bFGF、EGF，分别配成浓度为50ug/ml、30ug/ml的储液，置于-20℃备用。将以上各种成分充分混合，加入到去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。实施例2：培养液的制备DMEM粉末：10g(购买于：Sigma)转铁蛋白储液：1.2ml(购买于：Sigma)bFGF储液:1.4ml(bFGF购买于：Sigma)EGF储液:1.6ml(EGF购买于：Sigma)IL-3：5ug(购买于：Sigma)蜂胶黄酮：9mg（购买于：陕西森弗天然制品有限公司）黄芪皂苷：35mg（购买于：上海佰世凯化学科技有限公司）青霉素：8万单位(购买于：Sigma)链霉素：8mg(购买于：Sigma)上述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。上述的bFGF、EGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油分别溶解bFGF、EGF，分别配成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MDBK细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：DMEM粉末9‑12 g、转铁蛋白储液1‑3 ml、bFGF储液0.8‑4 ml、EGF储液0.8‑4 ml、IL‑3 1‑10 ug、蜂胶黄酮2‑30 mg、黄芪皂苷20‑60 mg、青霉素5‑10万单位、链霉素5‑10mg。

【技术特征摘要】
1.一种MDBK细胞培养液，其特征在于每1000ml去离子水中含有以下组分：DMEM粉末9-12g、转铁蛋白储液1-3ml、bFGF储液0.8-4ml、EGF储液0.8-4ml、IL-31-10ug、蜂胶黄酮2-30mg、黄芪皂苷20-60mg、青霉素5-10万单位、链霉素5-10mg。2.如权利要求1所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于每1000ml去离子水中含有以下组分：DMEM粉末10-12g、转铁蛋白储液1.2-2.6ml、bFGF储液1.2-2ml、EGF储液1.2-2ml、IL-32-8ug、蜂胶黄酮6-25mg、黄芪皂苷30-50mg、青霉素6-8万单位、链霉素6-8mg。3.如权利要求1或2所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于所述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。4.如权利要求1或2所述的一种MDBK细胞培养液，其特征在于所述的bFGF、EGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1的生理盐水和90%甘油分别溶解bFGF、EGF，分别配成浓度为50ug/ml、30ug/ml的储液，置于-20℃备用。5.如权利要求1或2所述的一种MDBK细胞培养液的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，张秀文，李阳，冷春青，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33