一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞的体外培养领域，具体是一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、IgG抗体筛选纯化获得裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞。本发明专利技术建立了一套分离、培养及鉴定裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。

Isolation and culture method of naked mole rat alveolar type II epithelial cells

The present invention relates to the field of cultured cells in vitro, in particular the method for isolation and culture of a naked mole rat alveolar type II epithelial cells by trypsin and elastase digestion, separation, filtering, differential centrifugation, IgG antibody screening naked mole rat type II alveolar epithelial cells. The invention provides a method of isolation, culture and identification of the naked mole rat alveolar type II epithelial cells, and the biological characteristics of cultured cells maintained by this method were assessed, confirmed that the training method can obtain high purity of the naked mole rat alveolar type II epithelial cells, which provides possibility for proliferation and differentiation liquid transport, further research on the synthesis of type II alveolar epithelial cell secretion and function changes in lung injury and repair of pathophysiologic conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法
本专利技术涉及细胞的体外培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。
技术介绍
裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪亚目、滨鼠科、异头鼠亚科、裸鼹鼠属、裸鼹鼠种。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧、高二氧化碳浓度的环境。裸鼹鼠的寿命是啮齿类中最长的，可达近三十年；对癌症具有超级免疫力，至今仍没有发现裸鼹鼠自发癌症的例子。裸鼹鼠长寿、抗衰老、耐低氧、抗肿瘤等特性引起了科学家的广泛关注，针对这些特性的研究成果已发表在Nature、PNAS等著名刊物上。肺泡II型上皮细胞(alveolarepithelialcellstypeII，AECII)是肺的功能性细胞，作为渗透性屏障，具有阻止组织间隙的大分子物质流入肺泡腔的功能，可以分化成为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞，具有肺干细胞的特性，能分泌抗菌物质，在免疫方面起重要作用。大量研究表明，肺泡上皮II型细胞是肺癌的主要来源细胞，针对肺泡上皮II型细胞的深入研究有助于进一步了解肺癌发生机制和寻找有效的治疗方法。获得纯度较高的裸鼹鼠肺泡上皮II型细胞对于裸鼹鼠的耐低氧机制及抗肺肿瘤特性的研究是十分必要的。自Dobbs等首次报道对成年大鼠肺泡II型上皮细胞提取方法以来，有许多学者进行了这方面的研究，使得该分离培养技术也更加的完善，但体外培养的肺泡上皮II型细胞很快失去表达表面活性质的情况仍然存在，并很快会分化为I型肺泡上皮细胞。现有的裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞分离培养方法是借鉴小鼠肺泡上皮II型细胞分离方法，取成年动物肺组织，剪碎成约1mm3大小后，进入消化过滤步骤，然后进行差速贴壁培养及免疫筛选纯化获得肺泡II型上皮细胞。现有的方法中，消化步骤采用的胰酶和胶原蛋白酶浓度不是裸鼹鼠细胞分离最佳浓度，对肺泡上皮II细胞损伤较大。目前裸鼹鼠IgG还没有商品化的产品，采用小鼠的IgG进行筛选，对裸鼹鼠细胞表面的IgGFc片段受体的亲和性不高，并且IgG针对裸鼹鼠细胞分选的包被浓度还需要进一步摸索。裸鼹鼠肺泡上皮II型细胞原代分离纯度不高，不利于通过该细胞对裸鼹鼠进行耐低氧抗肿瘤等方面的研究，国外尚未见这方面研究的报道。为了研究裸鼹鼠肺泡上皮II型细胞在裸鼹鼠耐低氧抗肿瘤等方面发挥的作用，分离纯化、体外培养出较纯度的裸鼹鼠肺泡上皮II型细胞是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种裸鼹鼠的肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、IgG抗体筛选纯化获得裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞。本专利技术的第一方面，提供一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：A、将成年裸鼹鼠肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；B、按每只动物2mL的量加入组织消化液，33-37℃消化5min；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.03％-0.08％(W/V)胰酶，0.001％-0.01％(W/V)II型胶原酶，0.005％-0.02％(W/V)DnaseI。C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；D、将步骤B和步骤C重复5到8次，至组织块基本消失；合并细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；E、采用33-37℃预热的粘附培养基重悬细胞，接入包被IgG的培养皿中，置于33-37℃、3-5％CO2的环境下培养30-60min，轻柔收取未粘附的细胞再次接入包被IgG的培养皿中培养30-60min；所述粘附培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；F、吸取未黏附细胞，离心收集细胞，采用粘附培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO2的环境中培养20-30h换培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞。其中，步骤A具体还包括：将裸鼹鼠脱颈处死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台中尽快完整取下肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后将肺组织剪成1mm3小块，移入青霉素小瓶。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤A中，所述洗涤液的组成为：PBS溶液、0.01％(W/V)DnaseI。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤B中，所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液、0.05％(W/V)胰酶、0.005％(W/V)II型胶原酶、0.01％(W/V)DnaseI。本专利技术采用胰酶联合胶原酶消化的方法，一方面降低胰酶浓度，另一方面采用对细胞基质有消化作用而对上皮细胞无影响的II型胶原酶，从而在保证细胞消化效率的同时减少胰酶对细胞的损伤。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤C中，所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗、0.01％(W/V)DnaseI。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤D中，所述细胞筛为200目细胞筛。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤D中，100g离心5min收集细胞。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤E中，所述裸鼹鼠IgG包被浓度为：0.1mg/cm2；两次黏附的时间为：40min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤E中，所述粘附培养基的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗、0.01％(W/V)DnaseI。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤F中，在35℃、5％CO2的环境中培养24h后更换培养基。在细胞分离过程中，由于酶的作用，细胞受损释放出DNA，与细胞外基质形成DNA蛋白复合物，聚集细胞成团。因此，本专利技术在细胞分离全程各种溶液都加入了DnaseI，防止细胞聚团。本专利技术优点在于：1、本专利技术的裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法在已有方法上作了重要改进，以成年裸鼹鼠肺组织作为细胞提取的组织来源，一方面降低胰酶浓度，另一方面采用对细胞基质有消化作用而对上皮细胞无影响的II型胶原酶，从而在保证细胞消化效率的同时减少胰酶对细胞的损伤。应用裸鼹鼠IgG免疫筛选去除含有IgGFc片段受体的成纤维细胞，肺泡巨噬细胞，淋巴细胞和中性粒细胞，而裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞没有IgGFc片段受体，因此免疫筛选后去除了大部分细胞。差速贴壁的时间也是成功分离肺泡上皮细胞的关键，成纤维细胞贴壁时间短，免疫吸附的时间由差速贴壁的时间需求来决定。将细胞悬液反复短时贴壁，本专利技术采取两次各40min贴壁。2、本专利技术建立了一套分离、培养裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。附图说明图1为倒置显微镜观察原代本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将裸鼹鼠肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液、0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；B、按每只动物2mL的量加入组织消化液，33‑37℃消化5min；所述组织消化液的组成为：D‑Hanks溶液，0.03％‑0.08％(W/V)胰酶，0.001％‑0.01％(W/V)II型胶原酶，0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％‑15％(V/V)FBS、0.5％‑2％(V/V)PS双抗、0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；D、将步骤B和步骤C重复5到8次，至组织块基本消失；合并细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；E、采用33‑37℃预热的粘附培养基重悬细胞，接入包被IgG的培养皿中，置于33‑37℃、3‑5％CO2的环境下培养30‑60min，轻柔收取未粘附的细胞再次接入包被IgG的培养皿中培养30‑60min；所述粘附培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％‑15％(V/V)FBS、0.5％‑2％(V/V)PS双抗、0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；F、吸取未黏附细胞，离心收集细胞，采用粘附培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33‑37℃、3‑5％CO2的环境中培养20‑30h换培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种裸鼹鼠肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将裸鼹鼠肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液、0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；B、按每只动物2mL的量加入组织消化液，33-37℃消化5min；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.03％-0.08％(W/V)胰酶，0.001％-0.01％(W/V)II型胶原酶，0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；D、将步骤B和步骤C重复5到8次，至组织块基本消失；合并细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；E、采用33-37℃预热的粘附培养基重悬细胞，接入包被IgG的培养皿中，置于33-37℃、3-5％CO2的环境下培养30-60min，轻柔收取未粘附的细胞再次接入包被IgG的培养皿中培养30-60min；所述粘附培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；F、吸取未黏附细胞，离心收集细胞，采用粘附培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO2的环境中培养20-30h换培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔淑芳，丛薇，李周桐，杨文静，余琛琳，赵善民，林丽芳，程继帅，刘攀，徐晨，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31