The invention discloses a mouse intestinal 3D organ building method for drug transport model of BCRP mediated; first isolated from mouse small intestinal crypts, suspended in Matrigel after access to cell culture plates, with Respondin 1, m Noggin and m EGF three cell growth factor ADMEM/F12 medium to promote the differentiation of 3D crypt like organs; and then morphological observation, BCRP gene and protein expression were detected to verify the feasibility of the model theory; the method of CO incubation, the use of BCRP Hoechst 33342 fluorescent substrate and inhibitor Ko143 or YHO 13177 of BCRP in class 3D transmembrane organ transport activity. The present invention is constructed for the first time in vitro model drug 3D in small intestine of mice organs of BCRP mediated transport across cell membranes, the model construction method is simple, rapid and efficient detection, can be widely used in BCRP substrate and inhibitor screening in vitro.
【技术实现步骤摘要】
一种小肠3D类器官研究BCRP介导药物转运模型的构建方法与应用
本专利技术属于生物医药
,具体涉及一种小肠3D类器官模型的构建及其在BCRP介导的药物转运研究中的应用。
技术介绍
ABC转运蛋白超家族,由两个跨膜结构域及两个细胞质ATP结合域组成,参与多种内源和外源性底物的转运,例如胆固醇,肽,药物,毒素,胆汁盐,有机阴离子,核苷,铁,氯离子以及固醇等。到目前为止,已知发现49种人的ABC转运蛋白成员,并分为七个亚家族(ABC-A至ABC-G)。其中P-糖蛋白(P-gp,ABCB1),MDR相关蛋白-1(MRP1,ABCC1)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP,ABCG2)与多药耐药现象密切相关,因此,ABC转运蛋白被认为是克服肿瘤耐药治疗的重要靶标。癌细胞的耐药性是癌症化疗中的主要问题。耐药的最主要机制是ATP结合盒转运蛋白超家族的成员以能量依赖的方式从细胞中泵出多种结构上不相关的抗癌药物,例如蒽环霉素,长春花生物碱和紫杉烷,导致药物在细胞内的积累减少。BCRP是关键的多药耐药蛋白之一,显著影响许多药物,尤其是抗癌药物的治疗效果。因此,确定某一药物或化合物是否为BCRP的底物,对该药物的临床使用和新药的研发具有很重要的意义。目前已经发现,BCRP可以外排米托蒽醌、甲氨蝶呤、黄酮吡醇、吉非替尼、伊马替尼和喜树碱类包括7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38,伊立替康的活性代谢物)及拓扑替康,减少细胞内的药物浓度,降低这类药物的治疗作用。一些证据表明,肠道中的BCRP是口服属于BCRP底物的药物如拓扑替康的生物利用度和功效的主要决定因素。此外,BCRP高表达于癌 ...
【技术保护点】
一种小肠3D类器官的培养方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)分离小肠隐窝:利用EDTA消化小鼠小肠分离得到小肠隐窝;(2)接种:用基质胶混悬后接种于培养板中;(3)培养:基质胶凝固后加入含有生长因子的ADMEM/F12完全培养基,进行培养。
【技术特征摘要】
1.一种小肠3D类器官的培养方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)分离小肠隐窝:利用EDTA消化小鼠小肠分离得到小肠隐窝;(2)接种:用基质胶混悬后接种于培养板中;(3)培养:基质胶凝固后加入含有生长因子的ADMEM/F12完全培养基,进行培养。2.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于,步骤(1)中,所述EDTA的浓度0.5mM-5mM;所述消化时间为15-30分钟。3.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于,步骤(2)中,所述基质胶为低生长因子,无酚红基质胶;每微升基质胶中含5-10个隐窝。4.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于,步骤(3)中,所述培养的温度为37℃;所述培养的时间为2-6天。5.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于,步骤(3)中,所述ADMEM/F12完全培养基的组分和浓度为1mMN-乙酰,10mM谷氨酰胺,10mMHEPES,1xB27,1xN2和1xPrimocin;所述生长因子的总浓度为650ng/mL。6.如权利要求4所述的培养方法,其特征在于,所述生长因子为Respondin-1,m-noggin和m-EGF三种细胞分化生长因子的组合;所述生长因子的浓度分别为500ng/mLRespondin-1,100ng/mLm-noggin和50ng/mLm-EGF。7.如权利要求1~6之任一项所述方法培养得到的小肠3D类器官,其特征在于,所述小肠3D类器官由上皮细胞、潘氏细胞以及干细胞等组成,其腔内侧模拟小肠绒毛结构,表达BCRP蛋白;相应的其外侧可模拟小肠的基底侧。8.一种用于培养小肠3D类器官的培养基,其特征在于,所述培养基包括以下组分:1mMN-乙酰,10mM谷氨酰胺,10mMHEPES,1xB27,1xN2,1xPrimocin和650ng/mL生长因子,其余为水。9.如权利要求8所述的培养基在培养小肠3D类器官中的应用。10.一种用于研究BCRP介导的药物转运模型的构建方法,其特征在于,具体方法包括以下步骤:(1)对按权利要求1~6之任一项所述方法培养得到的小肠3D类器官中BCRPmRNA表达水平进行测定;(2)免疫组织化学方法检测小肠3D类器官中BCRP蛋白的表达水平;(3)通过BCRP底物、BCRP抑制剂对小肠3D类器官进行功能验证;将小肠3D类器官与BCRP经典底物进行共孵育,同时将小肠3D类器官与BCRP抑制剂进行共孵育,通过测定底物的量来评价抑制剂的作用,进而对小肠3D类器官进行功能验证。11.如权利要求10所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,所述方法包括:利用Trizol法提取小肠绒毛、隐窝以及小肠3D类器官中的总RNA,并使用逆转录试剂盒合成cDNA;以合成的cDNA为模板,进行实时荧...
【专利技术属性】
技术研发人员:王昕,张磊,刘明耀,
申请(专利权)人:华东师范大学,
类型:发明
国别省市:上海,31
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