一种犬肝细胞的分离与培养方法技术

本发明专利技术属于细胞分离与培养领域，具体涉及一种犬肝细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：S1,活体取肝；S2,灌流；S3,肝细胞分离；S4，肝细胞培养。所述灌流是指向冲洗后的肝脏灌注37℃预热的灌流液A 15‑20min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液B3‑5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液C 4‑6min，最后将含有三抗的4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，所述三抗与基础培养基的体积比为1:99。此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，肝细胞形态完整，贴壁良好，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。

Method for separating and culturing canine liver cells

The invention belongs to the field of cell separation and culture, in particular to a method for separating and culturing canine liver cells, comprising the following steps: S1, taking liver in vivo, S2, perfusion, S3, liver cell separation, S4, liver cell culture. The perfusion is perfusate A 15 20min to liver perfusion after washing 37 degrees preheating, the flow rate of 50ml/min, and then continue to the perfusate flow rate of 5min B3 perfusion 50ml/min 37 C preheating, then the liquid flow velocity of 20ml/min C with 37 C 4 preheating perfusion 6min. Finally, there are three - 4 DEG C with pre cooling medium poured on the surface of the liver, the three resistance and medium volume ratio is 1:99. The isolated liver cells obtained from this method are almost pure hepatic parenchymal cells. They are not only large in number, complete in shape, good in adherence and high in activity, but also retain various functions of hepatocytes.

【技术实现步骤摘要】
一种犬肝细胞的分离与培养方法
本专利技术属于细胞分离与培养领域，具体涉及一种犬肝细胞的分离与培养方法。
技术介绍
肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究，但要获得高活率、功能好的肝细胞，至今仍较困难，尤其是犬原代肝细胞。早期分离肝细胞的方法主要是非酶法分离肝细胞，包括机械法(如匀浆法)及螯合法。但是机械法对肝细胞损伤大，分离下来的肝细胞活率低；螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法等。根据结果显示，一步灌流结合组织块消化法获得的肝细胞形态完整性较差，大部分细胞不贴壁，活性差，功能不强，LDH漏出液、白蛋白分泌和尿素合成呈现不规律变化，无法模拟体内代谢情况。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种犬肝细胞的分离与培养方法，获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，肝细胞形态完整，贴壁良好，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。本专利技术提供了如下的技术方案：一种犬肝细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：S1,取肝，取新鲜的肝脏用灌流液A浸泡冲洗；S2,灌流，向冲洗后的肝脏灌注37℃预热的灌流液A15-20min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液B3-5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液C4-6min，最后将含有三抗的4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，所述三抗与基础培养基的体积比为1:99；S3,肝细胞分离，在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000-3500r/min,5-10min；S4，肝细胞培养，将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用RPMI1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的RPMI1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满RPMI1640生长培养基进行培养。优选的，所述S2中灌流液A的配方为每1000mL蒸馏水中溶解8.1816gNaCl、0.4995gKCl、2.3831gHEPES、0.4500g葡萄糖、0.1861gEDTANa2，调节pH至7.2，灌流液B的配方为每1000mL蒸馏水中溶解8.1816gNaCl、0.4995gKCl、6.8493gHEPES、0.4500g葡萄糖、0.5550gCaCl2，调节pH至7.2，灌流液C的配方为每500mL灌流液B中溶解0.1gⅣ型胶原酶。优选的，所述S2中三抗的配方为每毫升三抗母液含青霉素、链霉素和两性霉素B分别为1万U、1万ug和250ug。优选的，所述S4中RPMI1640贴壁培养基的配方为每250mLRPMI1640基础培养基中加入25mL胎牛血清、2.5mL三抗、4.59*10-4μmol胰岛素、4*10-5μmol地塞米松、0.16μg维生素C；所述RPMI1640生长培养基的配方为每250mLRPMI1640基础培养基中加入25mL胎牛血清和2.5mL三抗。本专利技术的有益效果是：利用原代肝细胞进行体外实验，与其他体外及体内实验方法相比，有自身显著的优点。肝细胞是分化程度很高的细胞，一旦失去体内生存环境，则很快失去分化再生的能力，一些生化功能也很快丧失。犬原代肝细胞经过两步胶原酶灌流消化法后，模拟体内环境，探究分离的肝细胞活性最佳时期，并对肝细胞培养过程中的代谢情况进行检测；使用两步胶原酶灌流法，这是目前国际上流行的肝细胞分离方法。先从门静脉用无钙、含EDTA的灌流液灌注，冲出血细胞；再用含钙和EDTA的灌流液冲出灌流液A，再换含四型胶原酶的灌流液灌注肝脏，除去残留EDTA的干扰，有利于激活胶原酶额活性，是肝组织软化分散，至肝细胞解离，肝脏表面明显的颗粒状为止，停止蛋白酶作用。经过细胞筛的多次过滤后，除去脉管组织和未充分消化的肝脏组织碎块。反复3次洗涤离心，除去非实质细胞和细胞碎片，即可产生大量的活性较高的肝细胞；此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，肝细胞形态完整，贴壁良好，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。附图说明图1是不同培养时间肝细胞形态变化图；图2是肝细胞上清液各项指标变化图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术进行详细的叙述。将取出的肝脏用灌流液A浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液A15min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液B3-5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液C4-6min，最后将含有三抗4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，三抗和基础培养基的体积比为1:99；其中灌流液A的配方为每1000mL蒸馏水中溶解8.1816gNaCl、0.4995gKCl、2.3831gHEPES、0.4500g葡萄糖、0.1861gEDTANa2，调节pH至7.2，灌流液B的配方为每1000mL蒸馏水中溶解8.1816gNaCl、0.4995gKCl、6.8493gHEPES、0.4500g葡萄糖、0.5550gCaCl2，调节pH至7.2，灌流液C的配方为每500mL灌流液B中溶解0.1gⅣ型胶原酶，三抗的配方为每毫升三抗母液含青霉素、链霉素和两性霉素B分别为1万U、1万ug和250ug；在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000-3500r/min,5-10min；将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用RPMI1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的RPMI1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满RPMI1640生长培养基进行培养，其中RPMI1640贴壁培养基的配方为每250mLRPMI1640基础培养基中加入25mL胎牛血清、2.5mL三抗、4.59*10-4μmol胰岛素、4*10-5μmol地塞米松、0.16μg维生素C；所述RPMI1640生长培养基的配方为每250mLRPMI1640基础培养基中加入25mL胎牛血清和2.5mL三抗。结果检测通过倒置显微镜观察的到图1；图1a是犬肝细胞刚分离完成后，在倒置显微镜下观察，两步胶原酶灌流分离的肝细胞呈现分散状态，呈圆球形，细胞核位于细胞中央；图1b是4h后，细胞贴壁生长，细胞体开始变平，细胞核隐约可见，细胞开始伸张生长，形态多为椭圆形，活力差的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种犬肝细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1,取肝，取新鲜的肝脏用灌流液A浸泡冲洗；S2,灌流，向冲洗后的肝脏灌注37℃预热的灌流液A 15‑20min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液B 3‑5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液C 4‑6min，最后将含有三抗的4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，所述三抗与基础培养基的体积比为1:99；S3,肝细胞分离，在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000‑3500r/min,5‑10min；S4，肝细胞培养，将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用RPMI 1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的RPMI 1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满RPMI 1640生长培养基进行培养。...

【技术特征摘要】
1.一种犬肝细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1,取肝，取新鲜的肝脏用灌流液A浸泡冲洗；S2,灌流，向冲洗后的肝脏灌注37℃预热的灌流液A15-20min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液B3-5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液C4-6min，最后将含有三抗的4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，所述三抗与基础培养基的体积比为1:99；S3,肝细胞分离，在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000-3500r/min,5-10min；S4，肝细胞培养，将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用RPMI1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的RPMI1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满RP...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，陶焕青，吴金节，王希春，冯士彬，李锦春，梁婷，徐怡钟，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34