一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术公开一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其包括以下步骤：(1)体外提取、鉴定并扩增T1DM患者的人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)；(2)将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs‑iPSCs)；(3)体外诱导hUSCs‑iPSCs分化为胰岛样细胞(ILCs)。本发明专利技术所述诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法将hUSCs重编程为iPSCs的高效诱导体系，并进而将hUSCs来源的iPS细胞诱导分化为胰岛样细胞，所述方法hUSCs来源丰富、取材无创、具备一定干性而易于转化的优点，从而为自体干细胞治疗1型糖尿病提供新的种子细胞以及克服了伦理和免疫排斥限制，为治疗1型糖尿病提供了新的治疗方案。

Method for inducing human disease specific urine derived stem cells to differentiate into islet like cells and uses thereof

The invention discloses a method for inducing disease specific urine derived stem cells to differentiate into islet like cell method, which comprises the following steps: (1) extraction, identification and in vitro amplification of human disease specific urine derived stem cells in patients with T1DM (hUSCs); (2) hUSCs in vitro for hUSCs source iPSCs (hUSCs iPSCs); (3) hUSCs in vitro iPSCs differentiation into islet like cells (ILCs). The induction of disease specific urine derived stem cells to differentiate into islet like cells in the hUSCs method of reprogramming iPSCs efficient induction system, and then the hUSCs derived iPS cells to differentiate into islet like cells, the method of hUSCs based rich source, noninvasive, with dry and easy transformation the advantages, to overcome the ethical and immune rejection limit for autologous stem cells provide new seed cells for the treatment of type 1 diabetes and provides a new treatment for the treatment of type 1 diabetes mellitus.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法及其用途
本专利技术涉及一种胰岛样细胞的获取方法及其用途，尤其是一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法及其用途。
技术介绍
糖尿病(DM,DiabetesMellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。细胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，对于己经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的B细胞或其替代物是最理想的治疗方法。近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于上述技术背景而提供一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，所述方法不存在伦理和免疫排斥限制，并且具有极高的诱导效率，有望成为诱导胰岛样细胞的种子细胞，提高了其在糖尿病治疗中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)体外提取、鉴定并扩增T1DM患者的人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)；(2)将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)；(3)体外诱导hUSCs-iPSCs分化为胰岛样细胞(ILCs)。作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)的体外提取方法为利用条件培养基筛选TIDM患者尿液中hUSCs。作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中hUSCs的鉴定方法为流式细胞术、细胞免疫荧光、westernblot或核型分析。作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的方法为逆转录病毒转染法。作为对上述技术方案的进一步改进，所述逆转录病毒为包含Oct3/4、Sox2、Nanog和Klf4四个基因的逆转录病毒质粒。作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的鉴定方法为细胞免疫荧光、RT-PCR、碱性磷酸酶染色或畸胎瘤实验。另外，本专利技术还公开一种上述所述的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法在治疗1型糖尿病中的用途。本专利技术的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法利用hUSCs来源丰富、取材无创、具备一定干性而易于转化的优点，将hUSCs重编程为iPSCs的高效诱导体系，并进而将hUSCs来源的iPS细胞诱导分化为胰岛样细胞，从而为自体干细胞治疗1型糖尿病提供新的种子细胞以及克服了伦理和免疫排斥限制，为治疗1型糖尿病提供了新的治疗方案。附图说明图1为本专利技术所述诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法的整体技术路线图；图2为本专利技术实施例1所述人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)的获取、鉴定技术路线图；图3为本专利技术实施例2所述hUSCs源性人iPSCs系的建立和鉴定的技术路线图；图4为本专利技术实施例4所述Transwell共培养体系示意图。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1尿源性干细胞的获取尿源性干细胞的获取的技术路线如附图2所示，其具体步骤如下：(一)体外提取并扩增1型糖尿病患者的尿源性干细胞(hUSCs)通过导尿管在无菌条件下搜集1型糖尿病患者尿液，4℃保存。离心尿液，弃上清液，PBS冲洗细胞。用细胞计数器计数，台盼蓝排除法测量细胞活力。将剩余细胞种植于24孔板，每孔约500个细胞，特殊培养基培养，2天换一次液。收集原代细胞用MTT试剂盒检测细胞增殖。细胞形态学和表型分析，发现存在三类细胞：①终末分化细胞：此类细胞占99％，不能贴壁，可更换培养基去除；②正在分化细胞：至少有四种细胞，1-2个/100ml尿液，3-4周后逐渐减少，传代后不能继续生长，可传代去除；③USC：约2.5个/100ml尿液，此类细胞6周后可扩增到1亿个(第4代)。(二)USC相关检测1)流式细胞术检测USC表面标志物，包括CD117、SSEA4、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45、CD31、CD34、CD133等。2)细胞免疫荧光及westernbolt检测不同细胞系相关蛋白表达，如CD31、vWF、c-Kit、vimentin、尿溶蛋白Ia、CK7、CK13、CK17、CK19、α-SMactin、calponin、desmin、myosin等。3)核型分析检测USC染色体稳定性。实施例2hUSCs源性人iPSCs系的建立和鉴定hUSCs源性人iPSCs系的建立和鉴定的实验流程如附图3所示，其具体步骤如下：(一)逆转录病毒质粒载体的准备包含Oct3/4，Sox2，Nanog和Klf4四个基因的逆转录病毒质粒pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Nanog、pMXs-Klf4及参照质粒pMXs-EGFP由Addgene公司购买，使用DH5α细菌进行扩增，琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定无误后，用QIAGEN大抽试剂盒大量抽提五个逆转录病毒质粒，纯化后备用。(二)人iPSCs系的构建和培养①小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)分离培养：ⅰ.断颈法处死孕13.5d昆明雌鼠，分离子宫，无菌获取胚胎；ⅱ.去除胚胎中内脏、头部、四肢和尾部；ⅲ.剪碎躯干，0.25％胰酶/1mMEDTA溶液消化20-30min，200目滤网过滤、离心、重悬后接种于100mm培养皿中，调整细胞浓度1×106/ml，置于37℃，5％CO2中培养，2-3d细胞长满后传代。MEF培养基：DMEM含10％FBS，2mML-Gin和50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素。②MEF饲养层制备：往生长良好的MEF中加入终浓度为12μg/ml的丝裂霉素C溶液，37℃，5％CO2中孵育2.25h，吸去含丝裂霉素C的培养基。用PBS漂洗两遍后，0.25％胰酶/1mMEDTA消化成单细胞悬液，以3.0×104/cm2密度接种到明胶铺被过的平皿中，过夜培养。铺好的饲养层在1～7d内可以较好地支持人iPSCs的生长并维持其全能性。③人iPSCs系的构建第一天：复苏Plat-A细胞，接种至明胶铺被的100mm培养皿中，置于37℃，5％CO2温箱孵育过夜。第二天：用3ml新的培养基替换掉旧培养基，新培养基中加1μl10mg/ml嘌呤霉素(终浓度为1μg/ml)和10μl10mg/ml稻瘟霉素S(终浓度为10μg/ml)，继续置于37℃，5％CO2温箱孵育至细胞长到80％-90％融合度(48h)。第四天：按1：5的比例将细胞接种到新的100-mm平皿，2到3天后细胞开始汇合。第六天：将处于对数生长期的Plat-A细胞用4ml0.05％胰酶/0.53mMEDTA消化下来，进行细胞计数并将细胞浓度调整到8×105/ml。接种8×106细胞(10ml)于100-mm平皿，置于37℃，5％CO2温箱孵育过夜。第七天：准备1.5-ml离心管，加入0.3mlDME本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)体外提取、鉴定并扩增T1DM患者的人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)；(2)将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs‑iPSCs)；(3)体外诱导hUSCs‑iPSCs分化为胰岛样细胞(ILCs)。

【技术特征摘要】
1.一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)体外提取、鉴定并扩增T1DM患者的人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)；(2)将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)；(3)体外诱导hUSCs-iPSCs分化为胰岛样细胞(ILCs)。2.如权利要求1所述的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)的体外提取方法为利用条件培养基筛选TIDM患者尿液中hUSCs。3.如权利要求1所述的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中hUSCs的鉴定方法为流式细胞术、细胞免疫荧光、westernblot或核型分析。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桦，杨力，程彦臻，李迪，曹丽婷，李丽珊，杨双莉，叶萌，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：广东,44