一种培养肝细胞的无血清培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养基技术领域，尤其涉及一种培养肝细胞的无血清培养基及其制备方法，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇2～10mg/L，烟酰胺30～100μg/L，硫酸软骨素0.2‑0.5mg/L，抗生素13‑16μM，胰岛素0.1～0.8mg/L，过氧化氢酶10‑17mg/L，全反式维甲酸2～7μg/L，肌醇10～60μg/L，雷帕霉素3～12μg/L，氯化胆碱7.2～11.8mg/L，叶酸3～9μg/L，黄体酮0.2～1.6mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20‑35μg/L，氨基酸1～30mg/L，在本发明专利技术的培养基中，干细胞生长良好，且细胞功能和活力明显优于含血清培养基，克服了传统含血清培养基的缺陷；本发明专利技术的无血清培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境。

Serum free medium for culturing liver cells and preparation method thereof

The present invention relates to the technical field of cell culture medium, in particular to a serum-free medium and preparation method of cultured hepatocytes, including basal medium and adding in the basic culture medium additive, the additive composition to final concentration, including cholesterol: 2 ~ 10mg/L, 30 ~ 100 nicotinamide g/L, 0.2 chondroitin sulfate 0.5mg/L, antibiotic 13 16 M insulin, 0.1 ~ 0.8mg/L, 10 catalase 17mg/L, all trans retinoic acid 2 ~ 7 g/L, inositol 10 ~ 60 g/L, rapamycin 3 ~ 12 g/L, choline chloride 7.2 ~ 11.8mg/L, 3 ~ 9 g/L of folic acid progesterone, 0.2 ~ 1.6mg/L, trace elements of 5 ~ 23 g/L, cell growth factor 20 amino acid 35 g/L, 1 ~ 30mg/L in the culture medium of the invention, the stem cells grow well, and the cell vigor and function is better than that of serum containing medium, overcome The defect of the traditional serum containing medium is reasonable, and the serum-free culture medium of the invention has reasonable collocation and synergistic effect among various components, and can provide sufficient nutrition and good environment for the growth and proliferation of cells.

【技术实现步骤摘要】
一种培养肝细胞的无血清培养基及其制备方法
本专利技术涉及细胞培养基
，尤其涉及一种培养肝细胞的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
利用动物细胞培养技术来验证化合物毒理学实验测试目前为止最为高效和可行的方法。随着生物技术在化合物毒理学安全评价应用领域和市场需求量的不断扩大，提高动物细胞培养和毒理学试验、延长维持时间以获得可靠结果，成为优化动物细胞培养过程和毒理学实验的核心。众所周知，动物细胞培养及毒理学试验的效果的经济性和效率起决定性作用的是培养基，培养基的优化是建立高效的动物细胞培养和毒理学试验过程的核心环节。因此，根据细胞在生长、代谢和毒理学试验表达过程中的营养需求，设计动物细胞培养基中营养物的成分、含量和配比是工作的重要内容。国内外许多商业化的培养基—般由基础培养基和血清或替代物组成，显著影响细胞生长、代谢和毒理试验现象表达这些培养基—般仅能确保细胞的稳定传代，并不能较好地支持细胞生长和毒理试验效果的表达，因而阻碍了细胞毒理学实验的普及和应用。中国专利申请CN102311938A公开了一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其包含基础培养基和添加组分，其中，所述添加组分包括：胰岛素0.1～10μg/mL、转铁蛋白0.5～10μg/mL、亚硒酸钠5～10μg/L、表皮生长因子1～100ng/mL、肝细胞生长因子1～100ng/mL、纤粘连蛋白0.1～1μg/mL、地塞米松0.1～10nmol/mL和胰高血糖素0.05～5μg/mL。中国专利申请CN105087465A公开了一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：基础培养基500mL；丝胶蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝细胞生长因子5～20ng/mL；表皮生长因子10～50ng/mL；青链霉素100U/mL，这些用于肝细胞培养的无血清培养基，但是，存在价格昂贵，不利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养等问题。市售的商业无血清培养基在血清替代方面多具有良好的表现，但在支持细胞培养和高效表达毒理学效果方面仍有诸多缺陷。因此，在进行动物细胞培养和毒理学实验时，多数无血清培养基难以充分、平衡地向细胞提供所需的营养物质。培养基利用率很低，造成极大的浪费。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种培养肝细胞的无血清培养基它不仅能够促进细胞的生长，还能够促进白蛋白的合成，长时间维持细胞活力。为解决上述问题，本专利技术提供了一种培养肝细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇2～10mg/L，烟酰胺30～100μg/L，硫酸软骨素0.2-0.5mg/L，抗生素13-16μM，胰岛素0.1～0.8mg/L，过氧化氢酶10-17mg/L，全反式维甲酸2～7μg/L，肌醇10～60μg/L，雷帕霉素3～12μg/L，氯化胆碱7.2～11.8mg/L，叶酸3～9μg/L，黄体酮0.2～1.6mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20-35μg/L，氨基酸1～30mg/L。优选的，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5～8mg/L，烟酰胺42～81μg/L，硫酸软骨素0.2-0.5mg/L，抗生素13-16μM，胰岛素0.3～0.6mg/L，过氧化氢酶10-17mg/L，全反式维甲酸3～6μg/L，肌醇25～42μg/L，雷帕霉素5～8μg/L，氯化胆碱8.5～10.2mg/L，叶酸4～7μg/L，黄体酮0.7～1.3mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20-35μg/L，氨基酸5～18mg/L。本专利技术提供的培养肝细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，基础培养基能够提供肝细胞的生存和最低的生理活动。胆固醇作为一种脂类，参与形成细胞膜，过氧化氢酶能够清除自由基，保护肝细胞免受超氧自由基损害等，胰岛素可通过作用于肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对能源的摄入和利用，同时促进肝细胞内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。硫酸软骨素能增加细胞的信使核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成以及具有促进细胞代谢的作用，与其他原料配合使用，能够达到更好的提高肝细胞的增殖倍数和细胞活率的效果。本专利技术对基础培养基的种类没有特殊的要求，可以为本领域技术人员所常知，例如，所述基础培养基为F12或RMPI1640培养基。细胞生长因子能够促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。优选的，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子组成，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子的重量比为1:(1.2～3.6)。优选的，本专利技术的培养基中还含有微量元素，所述微量元素为微量金属元素和/或维生素，所述微量金属元素为铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、镍、氟、钼、钒、锡、硅、锶、硼、铷中的至少一种。优选的，所述维生素为维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B13、维生素B15、对氨基苯甲酸中的至少一种。氨基酸是维持细胞生长的营养元素之一，优选的，本专利技术的培养肝细胞的无血清培养基中还含有氨基酸，所述所述氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸和L-天冬酰胺中的至少一种优选的，所述抗生素为链霉素和/或青霉素。一种培养肝细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：(1)向基础培养基中加入胆固醇，烟酰胺，硫酸软骨素，抗生素，胰岛素，过氧化氢酶，全反式维甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化胆碱，叶酸，黄体酮，微量元素，细胞生长因子，氨基酸，混合均匀，得到混合体系1；(2)将步骤(1)的混合体系调节pH至6.7-7.3，在3～8℃下搅拌2～5h；(3)将步骤(2)的产物用微米滤膜过滤，除菌后，即得。优选的，所述微米膜为孔径为0.1～0.3微米的滤膜。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：本专利技术的培养肝细胞的无血清培养基化学成分明确，在本专利技术的培养基中，干细胞生长良好，细胞形态、密度与含有血清的培养基相当，且细胞功能和活力明显优于含血清培养基，克服了传统含血清培养基的缺陷；本专利技术培养肝细胞的无血清培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够促进细胞的生长，还能够促进白蛋白的合成，长时间维持细胞活力。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术提供了一种培养肝细胞的无血清培养基，包括基础培养基F12培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇7mg/L，烟酰胺63μg/L，硫酸软骨素0.3mg/L，抗生素链霉素14μM，胰岛素0.4mg/L，过氧化氢酶13mg/L，全反式维甲酸4μg/L，肌醇32μg/L，雷帕霉素6μg/L，氯化胆碱9.2mg/L，叶酸5μg/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养肝细胞的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇2～10mg/L，烟酰胺30～100μg/L，硫酸软骨素0.2‑0.5mg/L，抗生素13‑16μM，胰岛素0.1～0.8mg/L，过氧化氢酶10‑17mg/L，全反式维甲酸2～7μg/L，肌醇10～60μg/L，雷帕霉素3～12μg/L，氯化胆碱7.2～11.8mg/L，叶酸3～9μg/L，黄体酮0.2～1.6mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20‑35μg/L，氨基酸1～30mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种培养肝细胞的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇2～10mg/L，烟酰胺30～100μg/L，硫酸软骨素0.2-0.5mg/L，抗生素13-16μM，胰岛素0.1～0.8mg/L，过氧化氢酶10-17mg/L，全反式维甲酸2～7μg/L，肌醇10～60μg/L，雷帕霉素3～12μg/L，氯化胆碱7.2～11.8mg/L，叶酸3～9μg/L，黄体酮0.2～1.6mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20-35μg/L，氨基酸1～30mg/L。2.根据权利要求1所述的培养肝细胞的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5～8mg/L，烟酰胺42～81μg/L，硫酸软骨素0.2-0.5mg/L，抗生素13-16μM，胰岛素0.3～0.6mg/L，过氧化氢酶10-17mg/L，全反式维甲酸3～6μg/L，肌醇25～42μg/L，雷帕霉素5～8μg/L，氯化胆碱8.5～10.2mg/L，叶酸4～7μg/L，黄体酮0.7～1.3mg/L，微量元素5～23μg/L，细胞生长因子20-35μg/L，氨基酸5～18mg/L。3.根据权利要求1或2所述的培养肝细胞的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为F12或RMPI1640培养基。4.根据权利要求1或2所述的培养肝细胞的无血清培养基，其特征在于，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子组成，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子的重量比为1:(1.2～3.6)。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟岱青，
申请(专利权)人：青岛金典生化器材有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37