一种细胞培养的载体与其制备方法以及制备角膜上皮移植片的方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种细胞培养的载体与其制备方法以及制备角膜上皮移植片的方法。本发明专利技术所述细胞培养的载体包括壳聚糖和胶原。壳聚糖和胶原共混，既可以克服胶原的透明性和力学性能差、降解过快的缺点，又可以改善壳聚糖的机械强度过大、降解过慢的弱点，通过不同比例的配比，可控制降解速度与角膜组织自身修复的速度相匹配。本发明专利技术所述制备角膜上皮细胞移植片的方法为脐带间充质干细胞经角膜基质细胞诱导后，以所述的细胞培养的载体为载体培养。本发明专利技术所述方法以脐带间充质干细胞作为种子细胞，具备比骨髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，并且取材更便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养的载体与其制备方法以及制备角膜上皮移植片的方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种细胞培养的载体与其制备方法以及制备角膜上皮移植片的方法。
技术介绍
健全的眼表上皮连同一个稳定的角膜前泪膜是维持角膜生理功能的组织解剖学基础。角膜上皮结构完整、功能正常对视力有重要影响，它的更新依赖于角膜缘干细胞健全的生理功能，由角膜缘基底层的干细胞增生和分化来取代脱落死亡的细胞。角膜缘干细胞作为角膜上皮细胞增生的储备力量，在正常情况下能维持眼表的稳定状态，保持角膜的透明性，其功能缺失即会导致眼表功能失常，从而失去角膜透明性甚至角膜盲，临床常见的疾病如酸碱化学伤、先天无虹膜、Stevens-Johnson综合征等，严重的可以导致眼表组织的广泛破坏，引起持续的角膜上皮缺损、慢性炎症、角膜混浊、新生血管入侵等一系列的角膜损害，严重危及视力。角膜移植是目前治疗角膜疾病的最有效的方法。但是传统角膜移植的供体来源非常有限，且还受到组织配型的限制，从而限制了其技术的发展。作为角膜修复材料，目前细胞载体应用最为广泛的是羊膜，羊膜作为角膜修复材料或者角膜基质有着很多的优势：抗炎、稳定眼表、促进角膜上皮修复等，但是羊膜厚度比较薄、降解速度快，容易携带病毒等缺点也限制了羊膜的应用。其次异种脱细胞角膜基质，特别是脱细胞猪角膜也是角膜修复材料研究的热点，但是作为异种角膜无疑增加了免疫排斥反应的可能，异种角膜基质可能携带不明病原微生物，其角膜基质基本成分为胶原，在眼表的降解速度太快，同时作为异种角膜能否被患者接受也是影响其临床应用的不可忽视的问题。角膜缘干细胞作为种子细胞来治疗眼表疾病，而自体干细胞移植对于双眼损伤患者不适用，对单眼受损患者，因从健眼取材，所以同时还可能造成健眼损伤，同种异体角膜缘移植，除这些原因外，异体移植引起的排斥反应是导致手术最终失败的主要原因。组织工程技术的发展给眼表疾病的诊治带来了希望，体外培养的角膜缘干细胞(LSC)是治疗双眼疾病患者的重要手段，而应用理想的载体作为细胞外基质(ECM)来种植种子细胞，形成近似体内的正常结构是组织工程化角膜构建成功的关键。近年来研究表明，间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一类来源于中胚叶的多潜能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，可作为种子细胞促进组织损伤的修复和再生。由于其组织来源广泛，易于体外扩增、免疫原性低等优点，已逐渐成为组织工程和细胞移植最理想的种子细胞。目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少和降低，并且取材时易对供体造成身体伤害。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种构建角膜上皮移植片的方法。本专利技术所述方法采用脐带间充质干细胞替代角膜缘干细胞以及骨髓间充质干细胞作为种子细胞，体外诱导其分化为角膜上皮细胞后，以壳聚糖-胶原复合物为载体，制成角膜上皮移植片，用于眼表重建。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种细胞培养的载体，包括壳聚糖和胶原。胶原作为细胞外基质的主要组成部分被广泛应用于组织工程相关的研究。胶原能与细胞周围基质相互作用、相互协调并成为细胞组织正常生理功能体一部分，并促进不同类型细胞生长，具有可降解性，能被蛋白酶分解，可促进细胞生长代谢，可与其他材料复合等优势。壳聚糖是一种带正电荷的高分子聚合物，具有良好的生物相容性、透明性以及可降解性，且其降解产物对机体无毒性，广泛应用于组织工程及药物载体的研究中。本专利技术以壳聚糖和胶原混合物作为细胞培养载体，既可以克服胶原的透明性和力学性能差、降解过快的缺点，又可以改善壳聚糖的机械强度过大、降解过慢的弱点。通过壳聚糖和胶原的不同比例的配比，可控制降解速度与角膜组织自身修复的速度相匹配，作为角膜修复材料实现对角膜损伤修复的桥梁作用。优选的，所述的载体中所述壳聚糖与胶原的质量比为1:30。本专利技术还提供了所述细胞培养的载体的制备方法，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，配制成壳聚糖-乙酸溶液，与胶原水溶液混合，除去气泡，置于模具中自然风干成膜，然后用5％的NaOH溶液浸泡30min，再用去离子水反复冲洗，浸泡24h干燥。优选的，所述壳聚糖-乙酸溶液中壳聚糖的含量为10g/L。本专利技术还提供了一种制备角膜上皮细胞移植片的方法，脐带间充质干细胞经角膜基质细胞诱导后，所述的细胞培养的载体即壳聚糖-胶原复合膜为载体培养。优选的，所述壳聚糖-胶原复合膜的湿态厚度约为20μm。在一些实施方案中，所述诱导为脐带间充质干细胞与角膜基质细胞共培养7d。在一些实施方案中，所述培养为将与角膜基质细胞共培养7d后的脐带间充质干细胞消化后接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，以后每2d换液，共培养7d。在一些实施方案中，所述共培养为分别将脐带间充质干细胞和角膜基质细胞用0.25％的胰蛋白酶消化3min，终止消化后1500rpm离心5min，去上清，分别用含10％胎牛血清的DMEM/F12重悬两种细胞重悬浓度至3×105个/mL，按2:1的体积比混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中，共培养7d。其中，所述角膜基质细胞的制备方法优选为取1周龄SD大鼠角膜加入胶原酶消化制成细胞悬液，按1×106/L密度接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，48h换液，以后每2-3d换液，待细胞生长70％-80％基本融合时用0.25％胰蛋白酶消化传代。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种细胞培养的载体与其制备方法以及制备角膜上皮移植片的方法。本专利技术所述细胞培养的载体包括壳聚糖和胶原。胶原和壳聚糖作为生物材料，具有良好的生物相容性、可降解性、无抗原性等许多优异性能，能够克服羊膜厚度比较薄、降解速度快，容易携带病毒等缺点。壳聚糖和胶原共混，既可以克服胶原的透明性和力学性能差、降解过快的缺点，又可以改善壳聚糖的机械强度过大、降解过慢的弱点，通过不同比例的配比，可控制降解速度与角膜组织自身修复的速度相匹配。本专利技术所述制备角膜上皮细胞移植片的方法为脐带间充质干细胞经角膜基质细胞诱导后，以所述的细胞培养的载体为载体培养。本专利技术所述方法以脐带间充质干细胞作为种子细胞，具备比骨髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，并且取材更便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示诱导后的hUC-MSC，其中A为倒置显微镜细胞形态图，B为免疫荧光鉴定图；图2示不同胶原含量的复合膜接触角；图3示不同胶原含量的复合膜的吸水率；图4示不同胶原含量的拉伸强度；图5示壳聚糖-胶原复合膜(上皮细胞片)免疫荧光染色图，其中A为未诱导hUC-MSCs(200×)，B为诱导hUC-MSCs(200×)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了进一步理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术进行详细阐述，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养的载体，包括壳聚糖和胶原。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养的载体，包括壳聚糖和胶原。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述壳聚糖与胶原的质量比为1:30。3.一种权利要求1所述细胞培养的载体的制备方法，其特征在于，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，配制成壳聚糖-乙酸溶液，与胶原水溶液混合，除去气泡，置于模具中自然风干成膜，然后用5％的NaOH溶液浸泡30min，再用去离子水反复冲洗，浸泡24h干燥。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖-乙酸溶液中壳聚糖的含量为10g/L。5.一种制备角膜上皮细胞移植片的方法，其特征在于，脐带间充质干细胞经角膜基质细胞诱导后，以权利要求1所述的细胞培养的载体为载体培养。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养的载体为壳聚糖-胶原复合膜，所述壳聚糖-胶原复合膜的湿态厚度约为20μm。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导为脐带间充质干细胞与角膜基质细胞共培养7d。8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，万丽，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44