靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子及其应用；本发明专利技术提供一种靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子，包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD‑1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD‑L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQ ID NO：1所示；同时提供应用该靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子的核苷酸、重组载体和重组细胞；本发明专利技术的靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子具有与肿瘤表面PD‑1分子更高亲和力。

Targeting PD 1 chimeric antigen receptor molecules and its application

The present invention relates to the field of molecular biology, in particular to a target PD 1 chimeric antigen receptor molecules and its application; the invention provides a PD targeting 1 chimeric antigen receptor molecules, including extracellular peptides, which are connected in series to the transmembrane region of the peptide and intracellular domain of the peptide. The extracellular peptide includes connected anti PD scFv 1 peptides, peptides, and PD connected to the extracellular domain of L1 peptide sequence of the extracellular domain of peptides is shown as SEQ ID NO:1; at the same time provide the application of targeting PD 1 chimeric antigen receptor molecules, nucleotide the recombinant vector and the recombinant cells; the invention of targeting PD 1 chimeric antigen receptor molecules with the surface of the tumor PD 1 higher molecular affinity.

【技术实现步骤摘要】
靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-inducedkillercells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Naturalkillercells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Naturalkiller-likeTcells，NKT)、Th1效应细胞(Effectorcells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentriticcells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达，至少有两方面的因素导致体内的T淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与T细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的T淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家专利技术一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Singlechainantibodyfragmentofvariableregions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigenreceptor，CAR-T)。嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(RegulatoryTcells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4，CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmedcelldeathprotein1/Programmedcelldeathprotein1ligand1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物keytruda和opdivo已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种具有与肿瘤表面PD-1分子更高亲和力的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用。本专利技术第一方面提供一种靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD-L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQIDNO：1所示。应当说明的是，所述跨膜区肽段为蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基，其氨基酸大部分是疏水性氨基酸；其中，所述跨膜区肽段包括但不限于CD28跨膜区肽段、CD8跨膜区肽段或PD-L1跨膜区肽段，当跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段时，所述PD-L1胞外区肽段与CD8跨膜区肽段还通过CD8的hinge区肽段相连。CD8跨膜区肽段的序列如SEQIDNO：2所示，CD8的hinge区肽段的序列如SEQIDNO：3所示，PD-L1跨膜区肽段的序列如SEQIDNO：4所示。进一步的，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB(又称CD137)、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。优选的，所述胞内结构域肽段选自相互连接的4-1BB和CD3ζ胞内结构域肽段，其序列分别如SEQIDNO：5和6所示。进一步的，所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋白失活。信号肽可选自免疫球蛋白轻链的信号肽、或是PD-1蛋白分泌的信号肽，其序列分别如SEQIDNO：7和8所示。优选的，本专利技术的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，由免疫球蛋白轻链的信号肽、抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、PD-L1胞外区肽段、CD28的跨膜区和胞内区肽段和CD3ζ胞内结构域肽段依次连接而成，其氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。本专利技术第二方面提供一种核苷酸，其编码本专利技术第一方面提供的嵌合抗原受体分子。本专利技术第三方面提供一种重组载体，其包含本专利技术第二方面提供的核苷酸。进一步的，所述载体为慢病毒载体，其可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD‑1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD‑L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD-L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述跨膜区肽段包括但不限于CD28跨膜区肽段、CD8跨膜区肽段或PD-L1跨膜区肽段，当跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段时，所述PD-L1胞外区肽段与CD8跨膜区肽段还通过CD8的hinge区肽段相连。3.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述胞内结构域肽段选自4-1BB、CD28、CD3ζ的胞内结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：董克海，
申请(专利权)人：董克海，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23