一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白，其编码序列和含有复合蛋白的修饰的T淋巴细胞。本发明专利技术还涉及上述复合蛋白和修饰的T淋巴细胞在预防和治疗乳腺癌中的用途。本发明专利技术构建的特异性嵌合抗原受体融合诱导性凋亡酶复合蛋白具有结合Her2受体，强化T淋巴细胞激活状态以及调控细胞凋亡功能；该修饰的T淋巴细胞能高效杀伤Her‑2阳性乳腺癌细胞，并且在药物AP1903的作用下能诱导修饰的T淋巴细胞凋亡，作为安全保障以终止其扩大性杀伤作用。

A chimeric antigen receptor and fusion inducing apoptotic enzyme complex protein

The present invention discloses a chimeric antigen receptor and fusion inducing apoptosis enzyme complex protein, its coding sequence and modified T lymphocyte containing compound protein. The present invention also relates to the use of the composite proteins and modified T lymphocytes in the prevention and treatment of breast cancer. Induction of apoptosis protein enzyme complex with Her2 receptor fusion specific chimeric antigen receptor constructed by the invention, enhanced T lymphocyte activation state and apoptosis function; the modification of T cells can effectively kill Her 2 positive breast cancer cells, T lymphocyte apoptosis and induce drug modification in AP1903 under the action of as a safeguard to terminate its expanding killing effect.

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白
本专利技术涉及基因工程学和肿瘤学领域，尤其是一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白及其构建方法，本专利技术还涉及上述复合蛋白在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
技术介绍
我国乳腺癌的发病率呈现逐年上升的趋势，特别是晚期转移乳腺癌的病例增多。目前治疗乳腺癌仍然是以手术为主的综合治疗。自从提出了“乳腺癌是全身性疾病”的概念以后，全身治疗的方案越来越受到重视。但是，已经发生全身转移的乳腺癌仍然属于难治之症，这些病例往往对多种化疗和放疗方案都不敏感，各种治疗手段除了稍能延长寿命，并没有突破性进展。研究发现，约25～30％的乳腺癌病人的癌组织细胞表达一种表皮细胞生长因子受体2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，Her2)。虽然Her2在乳腺癌的表达率不算高，但是阳性的病例往往预后差、发展快。Her2在乳腺癌中的过量表达不仅与癌细胞的增殖率和发生转移的机会呈正相关，而且这些病例往往对多种化疗放疗不敏感。这主要由于Her2作为表皮生长因子受体，具有促癌细胞生长，扩散和肿瘤血管增生等功能，因此，Her2蛋白是乳腺癌恶化的分子标记，现在临床上已经采用检测癌组织中Her2表达来预测乳腺癌病人的预后，抗Her2治疗也已经通过了试验阶段，正式应用于临床实践。2012年，我们课题组应用具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物双向功能的融合蛋白作为载体成功识别Her2阳性乳腺癌细胞，并能在人源化小鼠荷瘤模型中成功输送功能性RNA序列抑制肿瘤细胞增殖迁移。因此Her-2抗体是有效结合Her-2分子的蛋白分子。目前通过阻断Her2受体来治疗乳腺癌的途径主要有以下几类：1.抗Her2单克隆抗体：通过封闭乳腺癌细胞表面Her2受体，阻断其与各种生长因子的结合，从而抑制受体激活，同时诱导受体经胞吞作用进入细胞，减少细胞表面Her2的表达量。其中单抗Trastuzumab，又称herceptin，是第一个获美国FDA批准应用于晚期乳腺癌治疗的抗Her2药物。数年来多个中心大宗病例的临床应用结果证明，Herceptin单药治疗能使Her2阳性的晚期乳腺癌病例进入临床缓解期，并维持18个月之久。与化疗药物联合使用治疗已经发生全身转移的乳腺癌能增加肿瘤对化疗的敏感性，明显地延长病人的寿命。但是，距离真正有效地控制和治愈乳腺癌，Herceptin的疗效尚不够理想，这主要由于乳腺癌细胞Her2受体是在基因水平过量表达，而Herceptin只是通过阻断受体蛋白起作用，新的Her2蛋白仍在源源不断地合成并输送到细胞膜，补充丧失的受体。而且鉴于心脏毒性和过敏反应，单抗的用量不可能无限制地加大。另一方面，Herceptin只作用于Her2跨膜蛋白的细胞外部分，其胞内部分的酪氨酸激酶仍可被邻近未被阻断的表皮生长因子受体激活来传导增殖信号。2.酪氨酸激酶抑制剂：Her2刺激细胞增殖的信号主要通过酪氨酸激酶系统的级联活化来传导。通过抑制Her2受体蛋白胞内部分的酪氨酸激酶(如细胞外信号调节激酶Erk1抑制剂)，在细胞培养和动物实验中能抑制乳腺癌细胞增殖。但是与酪氨酸激酶抑制剂往往只针对级联网络系统的某一环节，而Her2信号还可以通过旁路途径传导。此外，酪氨酸激酶抑制剂不能直接抑制过量表达的Her2基因，更不能彻底地阻断Her2蛋白的合成。更重要的是，酪氨酸激酶也是正常细胞所必需，使用其抑制剂干扰了很多正常组织细胞的信号传导途径，引起多种毒副作用。因此，要进一步扩展抗Her2治疗乳腺癌的临床成果，有必要发展毒性低，又能彻底抑制整个Her2跨膜蛋白表达的有效方法。3.传统的反义基因方法：包括特异性的反义寡核苷酸和核糖酶(ribozyme)均曾用于抑制乳腺癌细胞Her2基因表达的实验研究。但是由于这些传统的反义基因方法抑制基因表达的效果较弱，因此不能满足临床应用的需求。4.CART细胞即过继性细胞免疫治疗是抗肿瘤治疗中的新型手段CAR-T疗法，即ChimericAntigenReceptorTCellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。它是过继性细胞免疫治疗的一种，这一概念较早就出现，是近几年才被改良使用到临床上，并在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤等肿瘤的治疗上取得较显著的疗效的新型细胞疗法。被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T技术经过一系列漫长的演化过程中，逐渐走向成熟，并在抗肿瘤治疗上展现出日益优越的特点。人体内正常免疫细胞在执行抗肿瘤功能时主要以识别并启动杀伤途径达到清除肿瘤细胞的作用，其中，T淋巴细胞是主要直接杀手。但由于肿瘤细胞的免疫逃逸以及表面抗原的多变性使得具有抗肿瘤细胞功能的免疫细胞不能及时识别肿瘤细胞造成肿瘤细胞不能被及早完全清除而形成肿瘤，进而危害人体健康。而具有特异抗原受体修饰的T淋巴细胞可以直接识别肿瘤抗原，并快速活化启动杀伤效应，可达到快速，特异，精准的效果。细胞凋亡(apoptosis)，是生物体细胞的主动消亡过程，是多细胞有机体调控机体发育、控制细胞衰老、维持内环境稳定的重要机制。一般认为，细胞凋亡存在三条主要通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡。其中，胱天蛋白酶(caspases)-9是线粒体通路上启动细胞凋亡的一个关键蛋白，caspase-9酶原的激活可以启动下游效应蛋白酶从而引起细胞凋亡。早在2001年已有科学家研究出一种诱导型的caspase-9(简称iCasp-9，与细胞内结合蛋白Fkbp12融合)可在药物AP1903的调控下自激活引起细胞凋亡，开启人为可调控的细胞凋亡，即通过药物可以及时让细胞“自杀”。这种设计随即在肿瘤细胞的研究上进行。后续的研究表明，AP1903对含有iCasp-9酶的细胞诱导凋亡快，体内代谢快，对机体其他部位影响小，是合适的调控药物。因此，iCasp-9可以作为调控细胞凋亡也即是控制CAR-T治疗的一个安全“按钮”。目前，CART细胞疗法在白血病等非实体肿瘤的治疗中取得显著的进展，在国外已进入临床试验阶段。而在实体瘤的治疗上也进行了较多尝试，如黑色素癌，前列腺癌等等。CAR-T治疗应用的主要障碍在于特异识别特定的肿瘤细胞时，可能出现的细胞脱靶效应，以及由于重新输入大量激活型T淋巴细胞可能诱发的细胞炎症因子风暴对患者的机体伤害。当大量CAR-T细胞输入体内在快速地杀伤肿瘤细胞时，有可能会因为肿瘤细胞凋亡产生的碎片等，引起自身机体短时间内大量炎症因子的产生，或因为大量杀伤产生级联放大效应，损伤正常器官细胞。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能避免诱发细胞炎症因子风暴，特异性识别并高效杀死肿瘤细胞并能够在淋巴细胞发生失常时及时诱导“自杀”的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白，所述复合蛋白由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成。此处抗原指Her2单链中的一个片段。在另一个方面，本专利技术还涉及一种分离的核酸，所述核酸编码上述复合蛋白。优选地，所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。在另一个方面，本专利技术还涉及一种载体，所述载体表达上述复合蛋白。可用于插入目的多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白，其特征在于，所述复合蛋白由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白，其特征在于，所述复合蛋白由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成。2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的复合蛋白。3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。4.一种载体，其特征在于，所述载体表达如权利要求1所述的复合蛋白。5.一种修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述修饰的T淋巴细胞表达如权利要求1所述的复合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋尔卫，姚燕丹，张明霞，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44