一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种恢复衰竭免疫细胞功能的融合蛋白，所述融合蛋白包含识别衰竭免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。识别功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体；激活扩增功能区采用细胞因子或功能类似突变体、或者表面受体的配体或功能类似突变体、或者激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞；其还涉及该融合蛋白的应用。试验表明，本发明专利技术制备的融合蛋白既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增识别的免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能，其可增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

Fusion protein for restoring exhaustion immune cell function and application thereof

The invention relates to a failure recovery function of immune cells fusion protein. The fusion protein containing the identification function failure of immune cells and activation of immune cells amplification failure, two functional areas connected by non functional amino acid fragment length. The identification function is checked by immune phenotype receptor antibody recognition failure of immune cell specific amplification; activation function area with cytokines or similar mutants, or surface receptor ligands or similar mutants, or activating antibodies to activate immune failure cells; it also relates to application of the fusion protein. The test showed that the prepared fusion protein can identify the failure of immune cells, and can activate the amplification of recognition of immune cells, restore immune cell antigen positive cells, which can enhance the inhibition of tumor growth and control of viral infection, has good clinical prospects and wide application range.

【技术实现步骤摘要】
一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
本专利技术涉及融合蛋白
，尤其涉及一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用。
技术介绍
癌症是常见且威胁人们生命和生活质量的最为严重疾病，由病毒感染而引起的慢性疾病更是困扰世界的难题。当前针对癌症的临床应用药物存在着各种不足，例如化疗药物副作用大，靶向药物容易产生耐药性(CurrPharmDes.2010，16:3-10)，免疫检查点抑制剂有效率低(NEnglJMed2012，366:2443-2454)，嵌合抗原受体T(Car-T)细胞疗法又有细胞因子风暴和复发率高的缺点(CurrOpinPediatr.2017，29:27-33)。中国HBV(乙肝病毒)感染的人群达上亿人(APJCP,2011，12:1405-1408)，长期的病毒感染还会导致肝硬化、AIDS、子宫颈癌、肝癌等更为严重的疾病(PNAS2012，109:1802-1829)，而市场上还缺乏治疗由HBV病毒引起疾病的有效药物(ClinicalScience2013，124:77-85)。因此，发现高效低毒新型治疗癌症与慢性病毒感染的药物，减少死亡率，提高患者的生活质量，是我国乃至世界医疗卫生领域最为迫切的课题和需求。肿瘤的发生是由于机体细胞分裂过程中发生基因突变，突变细胞的生长失去调节控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，会逐渐造成肿瘤抗原特异性T细胞的功能性衰竭(NatureMedicine1999，5:677-685)，形成对肿瘤的耐受，免疫系统对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，形成癌症(PNAS.2002，99:12293-7)。由病毒感染导致的慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果(TrendsImmunol.2014，35:51-60；Blood2007，109:4671-4678；CellDeathandDisease2015，6:e1694)。研究表明，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(TIL)和抗病毒特异性T细胞都表达免疫抑制性受体(PNAS2010，107:7875-7880；JI2007，178:2714-2720)，处于衰竭状态，丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性T细胞丧失分泌细胞因子的能力，如伽马干扰素(IFN-γ)等(Blood2013，121:1367-1376；J.Biomed.Biotechnol.2011，451694)。即使机体内存在大量的特异性T细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞(JImmunol2005；175:6169-6176)。在表型上，衰竭性T细胞普遍高表达免疫抑制检查点受体，例如程序性死亡受体(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L)，T细胞免疫球蛋白3(Tim-3)，细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(Lag-3)等(NatImmunol.2011；12:492-9)。这些信号通路的激活会抑制T细胞的扩增，降低效应T细胞的功能，促进T细胞的凋亡，引起免疫耐受(JClinInvest.2011，121:2350-2360)。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤或病毒感染细胞(TrendsImmunol.2015；36:265-276)，最终达到治愈的目的。抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体Pembrolizumab和Nivolumab与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上产生治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者上获得了肿瘤完全消失(NEnglJMed2012，366:2455-2465；NEnglJMed2012，366:2443-2454)。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果不理想(NATURE2014，515:568-571)，而且这种T细胞的恢复持续时间短(Science2016，354:1160-1165)，患者体内的特异性免疫细胞又会很快回到衰竭状态(Science2016，354:1165-1169)。同时，只是阻断T细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏T效应细胞的患者基本又不会产生临床效果(Nature2014，515:568-571)，限制其临床的治疗效果。利用白细胞生长因子的临床应用治疗肿瘤具有一定的效果和不同程度的副作用(SeminOncol.2015，42:539–548)。白介素2(IL-2)的临床应用是第一个癌症治疗的免疫疗法，能彻底清除肿瘤细胞，在部分癌症患者达到完全治愈的效果(Cancer2008，113:293–301；JCO2005，23:133-141)。但是，细胞因子对所有表达其受体的细胞都会产生激活作用，从而可能激活非目的性细胞，临床应用会产生一系列毒副作用，限制它的临床应用(JI2014，192:5451-5458)，所以目前IL-2的临床应用范围和疗效有非常大的局限性(Immunity2013，38:13-25)。利用激活性4-1BB抗体(Oncology2010，37:508-516)和ox-40抗体(CancerScience200899:361-367)激活患者的免疫系统同样也会产生副作用。同样，利用激活性配体4-1BBL和OX-40L也会激活T细胞，但这些作用都不能针对衰竭的特异性细胞(J.Leukoc.Biol.21011，89:989–999)截止目前，还没有一种既能针对性地识别衰竭的特异性T细胞，又能恢复其功能和扩增其数量的蛋白药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其既可识别衰竭性免疫细胞，又能扩增免疫细胞的数量，恢复免疫细胞的功能。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，从而使两个功能区的蛋白折叠不存在相互干扰，保证融合蛋白的双功能特征。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点。优选地，所述衰竭性免疫细胞的表型受体包括(但不限于)PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3，此类受体基因在免疫细胞表面的过度表达，导致免疫细胞的衰竭和功能缺少。优选地，所述PD-1的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示序列，所述PD-L1的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示序列，所述TIM-3的氨基酸序列为SEQIDNO：3所示序列，所述CTLA-4的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列，所述LAG-3的氨基酸序列为SEQIDNO：5所示序列。优选地，所述表型受体的特异性抗体包括(但不限于)PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、TIM-3抗体、LAG-3抗体，通过抗体与受体的结合，一方面阻断受体与其配体的结合与信号传达，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。

【技术特征摘要】
1.一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。2.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点。3.根据权利要求2所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述衰竭性免疫细胞的表型受体包括PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3，所述表型受体的特异性抗体包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、TIM-3抗体、LAG-3抗体。4.根据权利要求3所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1为SEQIDNO：1所示序列，所述PD-L1为SEQIDNO：2所示序列，所述TIM-3为SEQIDNO：3所示序列，所述CTLA-4为SEQIDNO：4所示序列，所述LAG-3为SEQIDNO：5所示序列。5.根据权利要求3所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1抗体包括SEQIDNO：6～9所示序列，所述CTLA-4抗体包括SEQIDNO：10～11所示抗体，所述PD-L1抗体包括SEQIDNO：12～13所示序列。6.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体、或者表型受体的配体或功能类似突变体、或者激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞。7.根据权利要求6所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子或功能类似突变体包括IL-2、IL-15、IL-21。8.根据权利要求7所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述IL-2为SEQIDNO：14所示序列，所述IL-15为SEQIDNO：15所示序列；所述IL-21为SEQIDNO：16所示序列。9.根据权利要求6所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述表型受体的配体或功能类似...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳喜连，刘根桃，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科医联创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31