抗神经酰胺抗体制造技术

公开了抑制细胞凋亡的针对神经酰胺的单克隆抗体。还公开了所述抗体的人源化和scFv形式。公开了通过施用抗神经酰胺抗体预防或治疗受试者中的细胞凋亡的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗神经酰胺抗体在先申请的交叉引用本申请要求于2014年8月7日提交的美国临时申请第62/034,453号的优先权。
本申请主要涉及抑制细胞死亡的抗体。尤其是，本专利技术涉及用针对神经酰胺的抗体抑制细胞死亡。
技术介绍
急性辐射综合征(ARS)(有时称为辐射中毒或辐射病)是在极短时间内(例如，在几分钟内)通过高剂量的穿透辐射(如高能X射线、γ射线和中子)照射大部分身体导致的急性病。这种综合征的主要原因是特定组织中的未成熟实质干细胞的耗竭。患有ARS的人的实例是广岛和长崎原子弹的幸存者，在1986年切尔诺贝利核电站(ChernobylNuclearPowerPlant)事件之后首次响应的消防队员，以及无意暴露于灭菌辐照器的一些。通常，虽然在剂量低至0.3戈瑞(Gy)或30拉德(rads)时可以观察到轻微的症状，但是用于诱导ARS的辐射剂量大(即，大于0.7戈瑞(Gy)或70拉德)。虽然一些综合征可发生在低至6Gy或600拉德时，但是辐射胃肠(GI)综合征会通常发生在剂量大于大约10Gy(1000拉德)时。由于胃肠道和骨髓的破坏性和不可修复的变化，这种综合征的存活极其不可能。辐射胃肠综合征一般可以分成三个时期。前驱期出现在暴露后的数小时内，并且综合征包括厌食、严重恶心、呕吐、肌痛性痉挛和腹泻。潜伏期在大约两天后开始，并且患者可能出现和感觉良好，然而，排列在肠胃道的细胞和骨髓中的干细胞正在死亡。暴露后不到一周，显病期开始，伴随包括不适、厌食、严重腹泻、发烧、脱水和电解质失衡的症状。由于感染、脱水和电解质不平衡，死亡通常发生在2周内。除了急性辐射综合征的治疗之外，目前使用骨髓移植来治疗一些恶性的和非恶性的疾病，其包括急性和慢性白血病、骨髓瘤、实体瘤。然而，骨髓移植经常在宿主中诱发多种免疫应答，其导致排斥移植物或移植物抗宿主病(在下文中，称为“GvHD”)。为除去或抑制患者的免疫系统而设计的移植前需要的预处理方案，使患者易受肿瘤复发和感染的影响。近来使用的非亲属供体和HLA非全同供体已经不幸地增加了GvHD的发生率。虽然T细胞从供体骨髓移植中的去除改善了GvHD，但是该策略仍增加了移植失败率，并且显著减小了治疗有益的移植物对肿瘤的影响。因此，总存活率没有改善。此外，尽管强有力的临床前数据，但是通过向皮质类固醇添加TNF拮抗剂来减少炎症细胞因子作用而改善GvHD结果的尝试(急性GvHD的护理标准)提供了有限的治疗益处。因此，迫切需要替代策略以降低辐射GI综合征和GvHD的发生率和严重性。
技术实现思路
概述本申请的一个方面涉及抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。本申请的另一个方面涉及抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，其与本申请所述的抗神经酰胺抗体相同的抗原决定簇结合。所述scFv包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。本申请的另一个方面涉及一种在有此需要的受试者中抑制细胞死亡的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。本申请的又一个方面涉及一种在受试者中治疗辐射GI综合征或改善辐射GI综合征的症状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。本申请的再一个方面涉及一种在有此需要的受试者中减轻GI综合征中的细胞死亡的方法。所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射后，施用有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。本申请的还一个方面涉及一种在有此需要的受试者中抑制GvHD中的细胞凋亡的方法。所述方法包括在所述受试者接受移植之前，或在所述受试者接受移植之后但在GvHD发病之前，施用有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在本申请的另一个方面中，所述移植是骨髓移植。附图说明附图图示本公开的一个或多个实施方式，并且与书面的说明书一起用于解释本公开的示例性实施方式的原理。图1A-B显示：(A)mAb2A2的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列，和(B)2A2克隆和人种系序列的氨基酸序列比对。图2A-B显示：(A)人源化2A2重链序列，和(B)人源化2A2重链序列。图3是使用粗上清液在体外对h2A2、9H10、9H11、7B10、9A2、6B5和6C8的生物活性的图。图4是用纯化抗体抑制Jurkat细胞凋亡的示例性的图，10Gy。图5是使用人源化2a2和鼠7B10、6c8和6b5抑制隐窝致死率的示例性的图。图6是小鼠抗体6B5、6C8、7B10、9H10、9H11、2A2和人源化2A2抗体(h2A2)的示例性序列的图，以及抗神经酰胺共有序列的描述。使用计算机程序MUSCLE多序列对比产生对比序列和共有序列。由于给出每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N‑末端起第1位上的Gly，自N‑末端起第2位上的Tyr或Phe，自N‑末端起第4位上的Phe或Leu，和自N‑末端起第6位上的Thr或His以及自N‑末端起第10位上的His或Asn；16‑17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N‑末端起第2位上的Asn或Ile，自N‑末端起第4位上的Phe或Ser，自C‑末端起第9位上的Thr，自C‑末端起第7位上的Tyr，自C‑末端起第6位上的Asn，自C‑末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7‑11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N‑末端起第4位上的Tyr或Thr；10‑16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N‑末端起第2位上的Ala或Ser，自N‑末端起第3位上的Ser，自N‑末端起第5位上的Ser或Asp，和自C‑末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N‑末端起第3位上的Ser或Asn，自N‑末端起第5位上的Lys或Ser，和自N‑末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N‑末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N‑末端起第2位上的Gln，自N‑末端起第7位上的Pro，和自N‑末端起第9位上的Thr。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.07 US 62/034,4531.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。2.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1包含序列GYTFTDHTIH(SEQIDNO:1)，所述重链可变区CDR2包含序列YNYPRDGSTKYNEKFKG(SEQIDNO:2)，重链可变区CDR3包含序列GFITTVVPSAY(SEQIDNO:3)，所述轻链可变区CDR1包含序列RASKSISKYLA(SEQIDNO:4)，轻链可变区CDR2包含序列SGSTLQS(SEQIDNO:5)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列QQHNEYPWT(SEQIDNO:6)。3.如权利要求2所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：a)包含SEQIDNO:7的重链可变区序列，或与包含SEQIDNO:7的重链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列；和/或a)包含SEQIDNO:8的轻链可变区序列，或与包含SEQIDNO:8的轻链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列。4.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1包含序列GYAFSSYWMN(SEQIDNO:9)，所述重链可变区CDR2包含序列QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQIDNO:10)，重链可变区CDR3包含序列RCYYGLYFDV(SEQIDNO:11)，所述轻链可变区CDR1包含序列KASQDINRYLS(SEQIDNO:12)，轻链可变区CDR2包含序列RANRLVD(SEQIDNO:13)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列LQYDEFPYT(SEQIDNO:14)。5.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：a)包含SEQIDNO:15的重链可变区序列，或与包含SEQIDNO:15的重链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列；和/或a)包含SEQIDNO:16的轻链可变区序列，或与包含SEQIDNO:16的轻链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列。6.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1包含序列GYTFTSYWMH(SEQIDNO:17)，所述重链可变区CDR2包含序列YINPSSGYTKYNQFKD(SEQIDNO:18)，重链可变区CDR3包含序列GGYYGFAY(SEQIDNO:19)，所述轻链可变区CDR1包含序列SASSSVSYMY(SEQIDNO:20)，轻链可变区CDR2包含序列LTSNLAS(SEQIDNO:21)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列QQWSSNPLT(SEQIDNO:22)。7.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：a)包含SEQIDNO:23的重链可变区序列，或与包含SEQIDNO:23的重链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列；和/或a)包含SEQIDNO:24的轻链可变区序列，或与包含SEQIDNO:24的轻链可变区序列具有至少约95％序列同一性的序列。8.如权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区CDR1包含序列GFSLTGYGVH(SEQIDNO:25...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉米·罗托洛，里夏德·科列斯尼克，
申请(专利权)人：索隆基特林癌症研究协会，赛络美医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US