二肽基肽酶IV酶近红外荧光探针底物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种二肽基肽酶IV的近红外荧光探针底物及其制备方法与应用，属生物医药技术领域。该探针底物为取代4-乙烯基苯胺的甘氨酸基脯氨酸衍生物GP-R，其可用于测定不同生物体系中DPP-IV的酶活。DPP-IV酶活测定的流程如下：选择GP-R酰胺水解反应为探针反应，在生理条件下定量检测单位时间内GP-R脱二肽基产物的生成量来测定各类生物样品中DPP-IV的活性。本发明专利技术可用于不同来源的体液、细胞及组织制备物中DPP-IV酶活的定量测定，DPP-IV酶抑制剂或诱导剂筛选。

Two peptide peptidase, IV enzyme, near infrared fluorescent probe substrate, preparation method and application thereof

The invention provides a near infrared fluorescent probe substrate of two peptide based peptidase IV, a preparation method and an application thereof, and belongs to the technical field of biomedicine. The probe substrate is a glycine proline derivative GP-R substituted for 4- vinyl aniline, which can be used for the determination of the enzyme activity of DPP-IV in different biological systems. DPP-IV enzyme activity determination process is as follows: GP-R amide hydrolysis reaction as a probe reaction under physiological conditions detected per unit time and two GP-R peptide based product formation to the determination of DPP-IV in biological samples in the activity. The present invention can be used for quantitative determination of DPP-IV enzyme activity in the body fluid, cell and tissue preparations from different sources, and screening for DPP-IV enzyme inhibitors or inducers.

【技术实现步骤摘要】
二肽基肽酶IV酶近红外荧光探针底物及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及二肽基肽酶IV酶近红外荧光探针底物及其制备方法与应用。
技术介绍
二肽基肽酶-IV(DipeptidylpeptidaseIV,DPP-IV,CD26,EC3.4.14.5)是以二聚体形式存在的Ⅱ型跨膜蛋白酶，广泛分布于哺乳动物脏器的上皮细胞及血管内皮细胞，其中在小肠和肾中表达最高，也能以溶解形式存在于体液中。作为重要的I相代谢酶，DPP-IV能特异性地催化多肽链N末端第2位的氨基酸残基脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)肽键水解断裂，从而参与体内多种生物活性多肽的激活，以及使多种活性多肽部分或完全失活，如肠促胰岛素、神经肽、胃泌素释放肽、生长激素释放激素等。DPP-IV在糖代谢过程中扮演重要角色，已经成为了治疗2型糖尿病新靶点，同时也被FDA批准为重要的药物作用靶点。另外它还是细胞膜受体和共刺激分子，从而参与机体的免疫调节、细胞移行、细胞黏附和细胞调亡过程，故与多种疾病的发生发展密切相关。研究表明，DPP-IV在一些肿瘤细胞中高表达(结肠癌、原发性肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、食道恶性腺瘤等)，利用DPP-IV代谢活化机制，以DPP-IV为潜在靶点，可以设计靶向性的抗癌前药。临床研究表明许多疾病会引起患者血液/尿液DPP-IV含量显著改变，如肝病癌患者血液/血清DPP-IV含量显著高于正常人，糖尿病肾病患者尿液DPP-IV含量明显增高。有报道称检测血液/血清或尿液中的DPP-IV可作为某些疾病诊断和评估的标志物。因此，DPP-IV酶的活性检测具有广阔的临床应用前景，对疾病的早期诊断、评估及预后治疗，以及高效筛选DPP-IV抑制剂作为糖尿病治疗的候选药物等。目前，定量评估DPP-IV的方法主要包括对硝基苯胺衍生物GP-pNA底物显色法和4-甲基-7-氨基香豆素衍生物GP-AMC荧光探针法。GP-pNA体系多适用于含单一成分DPP-IV的检测(如单酶体系DPP-IV抑制剂的筛选)，实际生物样品检测中存在样品制备与分析流程繁琐、测试通量低、成本高、生物基质干扰大等缺陷。而GP-AMC体系应用于生物样品(体液、细胞、组织等)检测时，由于吸收和发射波长所限(λex＝360/λem＝460nm)容易受到生物基质背景吸收和背景荧光的干扰，使得荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响，应用时容易得到假阳性或假阴性的结果。近年来，随着人们对DPP-IV与疾病发生发展关系研究的深入，现存的DPP-IV荧光探针的性能已经不能满足人们对DPP-IV精确定量评估方法的需求，特别是针对血液、尿液、癌细胞/组织等复杂生物体系的快速检测或功能成像。因此，急需开发一种操作简单、抗干扰能力强、可高灵敏定量检测复杂生物体系DPP-IV活性的荧光探针底物。近红外(NIR)荧光探针由于其激发和检测可避免环境和生物样品产生的背景噪声,可以有效地避免生物样品的自吸收和自荧光的干扰。同时,在生物光学窗口(600m-900nm)范围内，避开了生命体系所不能承受的紫外-可见光损伤，降低了光漂白和光损伤。另外，近红外荧光成像可以穿透的组织,弥补了光学成像中组织穿透性低的缺陷。因此,近红外荧光探针在复杂生物样品分析检测中有明显的优越性。开发高选择性的DPP-IV近红外荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特异性及红外近红外荧光探针底物及其应用，该荧光探针底物和去二肽基化产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物的荧光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中DPP-IV的分布和功能进行定量评价。本专利技术提供了一种DPP-IV的特异性荧光探针底物，该探针底物可被DPP-IV特异性催化生成具有不同荧光属性的产物并生成相应的取代芳胺，该底物结构式如下：其中，X选自O、N；R选自C1-C10烷基、-(C1-C8亚烷基)-羧基、-(C1-C8亚烷基)-酯基、-(C1-C8亚烷基)-氨基、-(C1-C8亚烷基)-氰基、-(C1-C8亚烷基)-硝基、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、碳环基、-(C1-C3亚烷基)-碳环基、芳基、-(C1-C3亚烷基)-芳基、杂芳基、-(C1-C3亚烷基)-杂芳基、杂环基或-(C1-C3亚烷基)-杂环基。本专利技术提供了一种二肽基肽酶IV近红外荧光探针底物的制备方法，其特征在于：1)以2-乙酰基苯酚为起始原料，经过碱催化乙酰化合成2-乙酰基乙酰苯酚2，酸催化环化合成黄酮3；2)酸催化黄酮3与丙二腈反应合成二氰苯并吡喃4，或黄酮3与取代胺反应合成酸性/中性/碱性、极性/非极性、亲水/疏水、及大小不一的系列取代基团的N-取代喹啉酮5，在与丙二腈反应合成二氰N-取代喹啉6；3)二氰苯并吡喃4或二氰N-取代喹啉6与对氨基苯甲醛反应合成反式取代4-乙烯基苯胺7；4)反式取代4-乙烯基苯胺7(1.0eq)在N-羟基苯并三氮唑(0.5-2.0eq)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.5-2.0eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.0-3.0eq)存在下，与叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸(1.0-3.0eq)缩合，20-30℃搅拌反应24-48小时，生成的产物经柱层析纯化，再经三氟乙酸酸催化，20-30℃搅拌反应4-10小时脱除叔丁氧羰基生成二肽基肽酶IV的近红外荧光探针底物GP-R，纯化后产率为30-80％。该反应的反应路线如下：本专利技术还提供一种测定DPP-IV的特异性荧光探针底物的应用，采用该DPP-IV特异性底物，与含DPP-IV的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其去二肽基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中DPP-IV的活性，具体测定方法及条件如下：A.体系中以GP-R作为比率型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；B.在PBS缓冲液中，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；C.反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的N-去二肽基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；D.测定单位时间内底物减少量或N-去二肽基化产物生成量作为DPP-IV活性的评价指标。具体测定方法及条件中，单点测定时底物浓度优选Km。具体测定方法及条件中，反应温度优选37℃，孵育体系pH优选pH7.4。所述的生物体系为重组表达DPP-IV单酶、人或动物血液/血清、尿液、组织制备液或各类哺乳动物组织细胞及其制备物中的任意一种。该探针底物及其去二肽基产物具有不同的紫外吸收和荧光发射波谱，可用于紫外和荧光检测。该探针底物还可用于DPP-IV抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。该特异性探针底物为近红外荧光探针，其在DPP-IV活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组DPP-IV、人及动物组织制备液、血液/血清、尿液及各类组织细胞中DPP-IV酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体DPP-IV的探针底物，评估代谢酶DPP-IV的个体及种属差异。该探针底物及N-去二肽基化代谢产物的荧光检测方法还可用于DPP-IV抑制剂的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二肽基肽酶IV的近红外荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被DPP‑IV特异性催化发生肽键水解反应并生成相应的芳胺,该探针底物的结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种二肽基肽酶IV的近红外荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被DPP-IV特异性催化发生肽键水解反应并生成相应的芳胺,该探针底物的结构如下：其中，X选自O、N；R选自C1-C10烷基、-(C1-C8亚烷基)-羧基、-(C1-C8亚烷基)-酯基、-(C1-C8亚烷基)-氨基、-(C1-C8亚烷基)-氰基、-(C1-C8亚烷基)-硝基、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、碳环基、-(C1-C3亚烷基)-碳环基、芳基、-(C1-C3亚烷基)-芳基、杂芳基、-(C1-C3亚烷基)-杂芳基、杂环基或-(C1-C3亚烷基)-杂环基。2.一种如权利要求1所述二肽基肽酶IV近红外荧光探针底物的制备方法，其特征在于：1)以2-乙酰基苯酚为起始原料，经过碱催化乙酰化合成2-乙酰基乙酰苯酚，酸催化环化合成黄酮；2)酸催化黄酮与丙二腈反应合成二氰苯并吡喃，或黄酮与取代胺反应合成酸性/中性/碱性、极性/非极性、亲水/疏水、及大小不一的系列取代基团的N-取代喹啉酮，在与丙二腈反应合成二氰N-取代喹啉；3)二氰苯并吡喃或二氰N-取代喹啉与对氨基苯甲醛反应合成反式取代4-乙烯基苯胺；4)反式取代4-乙烯基苯胺，在N-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯存在下，与叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸缩合，20-30℃搅拌反应24-48小时，生成的产物经柱层析纯化，再经三氟乙酸酸催化，20-30℃搅拌反应4-10小时脱除叔丁氧羰基生成二肽基肽酶IV的近红外荧光探针底物GP-R，纯化后产率为30-80％；所述反式取代4-乙烯基苯胺、N-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，与叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸的摩尔比为1.0：0.5-2.0：0.5-2....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，钱星凯，葛广波，邹立伟，王平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21