本发明专利技术涉及一种定点突变改造的酵母二肽基肽酶III。本发明专利技术所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于Saccharomyces cerevisiae S288c的酵母二肽基肽酶III中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第570、572、574位的取代，以致所述定点突变改造的酵母二肽基肽酶III为对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶。本发明专利技术所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III可应用于制备饲料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双呋喃香豆素的产品，还可应用于制备预防由6-甲氧基双呋喃香豆素诱发的疾病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种二肤基肤酶III，特别设及一种定点突变改造的酵母来源的二肤 基肤酶ΙΠ。
技术介绍
二肤酶III(DPPsIII，EC3.4. 14. 4)，如来自酵母的二肤酶III、来自人类的二肤 酶III、来自大鼠的二肤酶III、来自兔的二肤酶III等，是一组分子内含有特殊的肥XXGH 锋指结构的金属蛋白酶，具有水解多肤链的氨基末端切掉二肤的肤酶。DPPIII在生理功能 上与脑啡肤和血管紧张素II、血管紧张素III、促黑色素等重要的生理活性肤的新陈代谢 有关。DPPs存在于各种哺乳动物的组织中，根据亚细胞的定位、特异性地无核抑制剂的敏 感性，二肤基肤酶分成不同的类型DPPI~DPPIV。DPPIII可W选择性地从多肤链或蛋 白质的N-末端水解掉二肤残基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。酵母来源的DPP III由712个氨基酸组成，锋离子是其催化金属离子。其氨基酸序列与黄曲霉毒素单加氧酶 (Aflatoxinmonooxygenas，AFMO)的同源性达到37%，但不具有对6-甲氧基双巧喃香豆素 氧化分解的功能。 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物，已经 确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1 (也称6-甲氧 基双巧喃香豆素）被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致癌诱变剂，一次大量摄 入会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄入会致崎、致突变和致癌，即使几 十ppb的含量仍有极大的毒性；I族黄曲霉毒素含有巧喃双键结构。目前，已经发现的对 6-甲氧基双巧喃香豆素具有分解作用的生物酶极少。黄曲霉毒素单加氧酶（AFM0)是一个 对6-甲氧基双巧喃香豆素有氧化分解作用的酶。经研究发现黄曲霉毒素单加氧酶氧化分 解6-甲氧基双巧喃香豆素的过程为：从底物分子中获得电子传递给氧，使水还原成过氧化 氨，将底物氧化并进一步使分子中的巧喃双键开环。在运个过程中，由分子内的变价离子的 价态变化来实现电子的传递，首先，结合在AFM0上的二价金属离子夺得底物的一个电子， 自身变成一价离子，然后不稳定的一价离子将夺得的运个电子传递给氧，自身又转变成稳 定的二价离子，氧气分子获得一个电子在水分子的参与下生成过氧化氨，同时底物转变为 它的环氧化物。然后，该环氧化物伴随着过氧化氨的作用发生氧化水解反应，最终使底物分 子中的巧喃双键断开。黄曲霉毒素单加氧酶是目前已报道的用于黄曲霉毒素解毒的生物 酶。因此，发现和制造新的对6-甲氧基双巧喃香豆素具有氧化分解作用的酶，对发展黄曲 霉毒素消减技术具有十分重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种定点突变的酵母二肤基肤酶III，该酵母二肤基肤 酶III突变体对6-甲氧基双巧喃香豆素具有氧化分解功能。 阳0化]本专利技术所述的一种定点突变改造的酵母二肤基肤酶ΙΠ是由氨基酸序列为SEQID NO. 1的来源于酵母SaccharomycescerevisiaeS288c的酵母二肤基肤酶III(NCBI数据库 登录号为NM_001183312)中制造多个氨基酸取代而产生的、对6-甲氧基双巧喃香豆素有氧 化分解作用的酵母二肤基肤酶III突变体，所述的氨基酸取代包括第570、572和574位的 取代。 根据本专利技术所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III的进一步特征，所述第 570位的氨基酸用丙氨酸（Alanine，ALa，A)取代赖氨酸（Lysine，Lys，K);第572位的氨基 酸取代是用赖氨酸化ysine，Lys，K)取代甘氨酸（Glycine，Gly，G);第574位的氨基酸取代 是用组氨酸化istidine,化s，H)取代色氨酸（T巧ptophan，T巧，W);所述的定点突变改造的 酵母二肤基肤酶III突变体的氨基酸序列为SEQIDNO. 2。 经实验验证，本专利技术所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III(W下缩写为 "myDPP")具有对于6-甲氧基双巧喃香豆素的氧化分解功能。该突变体酶在抑6.0、反应 溫度25°C处理6-甲氧基双巧喃香豆素（lOOppb) 50分钟后，其对6-甲氧基双巧喃香豆素的 氧化分解效率达到90%。该突变体酶的其它酶学性质与野生酶相似。 进一步地，本专利技术提供了一种DNA分子，其编码本专利技术所述的定点突变改造的酵 母二肤基肤酶III。 优选地，本专利技术所述的DNA分子的核巧酸序列为SEQIDNO. 3。 本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DM分子。 本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者 含有本专利技术所述的载体。 上述载体和宿主细胞都可W通过本领域公知的技术手段进行制备。 本专利技术还提供了本专利技术所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III的生产方法， 包括：在适于二肤基肤酶III表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从培养基中分 离所述的酵母二肤基肤酶III。 当本专利技术所述的DNA分子W合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体或者 转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可W在任何真核或者原核表达系统中表达。许多 宿主-载体系统都可W用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用隧菌 体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞 系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本专利技术优选的载体包括 病毒载体、质粒、粘粒或者寡核巧酸。 本专利技术优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本专利技术优选的蛋白质表达方法为毕赤 酵母甲醇诱导分泌表达。 本专利技术人成功地获得了一种定点突变改造的酵母二肤基肤酶III，通过活性鉴定 实验，证明该二肤基肤酶III突变体具有野生型二肤基肤酶ΠΙ所不具备的氧化分解6-甲 氧基双巧喃香豆素的生物活性，且该生物活性达到了应用于饲料及其添加剂加工、食品及 其添加剂加工W及药物开发的程度。 本专利技术的另一目的是提供将所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III在制备 饲料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双巧喃香豆素的产品的应用。结合目 前的饲料和食品的加工工艺，可将本专利技术所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III作为 脱毒剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化酶用于如花生油等食品的脱毒，或制 成能够表达该酶的益生菌制剂或益生菌微囊等用于食品、粮油、饲料等的脱毒。 本专利技术的另一目的是提供将所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III在制备 预防由6-甲氧基双巧喃香豆素诱发的疾病的药物的应用。结合目前的常规药物制备工艺， 可用本专利技术所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III制得到用于预防由6-甲氧基双巧 喃香豆素诱发的疾病（例如肿瘤）的药物。【附图说明】 图1为重组质粒myDPP表达质粒的鉴定图。 图2为重组myDPP和重组wtyDPP的纯化结果。【具体实施方式】 本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。W 下提供在本专利技术中使用的一些特殊术语的定义。 "wtyDPP"表示野生型酵母二肤基肤酶III，其基因W斜体wtyDPP表示。 阳02引 "myDPP"表示突变体酵母二肤基肤酶III，其基因W斜体myDPP表示。实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定点突变改造的酵母二肽基肽酶III，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于Saccharomyces cerevisiae S288c的酵母二肽基肽酶III中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第570、572、574位的取代，以致所述定点突变改造的酵母二肽基肽酶III为对6‑甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘大岭，姚冬生，吴曦阳，谢春芳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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