一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，首先将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀得到DNA/PEI复合物；将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基培养；然后将DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；然后以此转染T细胞，培养得到嵌合抗原受体T细胞。本发明专利技术以慢病毒包装系统为基础，达到60%以上的转染效率。

Preparation method of chimeric antigen receptor T cell

The invention discloses a method for preparing a chimeric antigen receptor of T cells, the chimeric antigen receptor expression vector and pGP plasmid, pVSVG plasmid and polyetherimide blend, and evenly DNA/PEI complex; 293 cells were seeded in culture dishes, then add the complete culture medium; then DNA/PEI composite droplets join in a Petri dish culture; 4 ~ 10 hours after removing the culture medium; then add the conditioned medium, cultured for 8 ~ 32 hours after collecting medium; then centrifuged and the supernatant obtained medium containing lentivirus; sucrose solution into the centrifuge tube, then the medium supernatant cultured in centrifuge tube join the wall containing lentivirus; then centrifuged and the supernatant after centrifugation to remove, adding the buffer; and then transfected into T cells, cultured T cell chimeric antigen receptor. The invention is based on a lentivirus packaging system and achieves more than 60% transfection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，可以明显提高载体对T细胞的转染效率。
技术介绍
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时存在MHC限制性，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性，形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击、肿瘤快速增殖利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体的T细胞治疗技术在体外和临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)由胞外抗原结合区，由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体(scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域免疫受体酪氨酸活化基序在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，目前CAR-T细胞的制备主要通过慢病毒将CAR稳定整合到T细胞的基因组中。慢病毒属逆转录病毒科下的一个属，以慢病毒为骨架的载体主要是从人免疫缺陷病毒HIV改进获得的，在体内能够感染几种不同组织来源的非分裂细胞和分裂细胞，如大脑、肝脏、肌肉及造血干细胞，在基因治疗领域有着非常广阔的应用前景。目前以慢病毒为基因转导载体的临床实验在一定程度上证明了慢病毒作为基因治疗载体的安全性虽然慢病毒属于逆转录病毒的一个属，但是其具有更为广泛的宿主范围，慢病毒能够感染非周期性和有丝分裂后的细胞，原代T细胞的慢病毒感染一直效率较低，平均不到20%，阻碍了以T细胞为基础的嵌合抗原受体免疫细胞治疗技术的广泛临床应用慢病毒对T细胞转染效率低主要有以下几个方面的原因，一是制备的慢病毒滴度较低；二是原代T细胞自身处于休止状态，导致感染进入细胞的慢病毒无法将外源基因整合至T细胞的基因组中；第三是慢病毒感染原代T细胞的实验方案未经优化。因此需要研发一种方法，以慢病毒包装系统为基础，创新慢病毒的包装制备工艺以及慢病毒的浓缩方法，采用新的慢病毒感染原代T细胞的流程，从而大幅度提高慢病毒对原代T细胞的感染效率，以此方法制备重组嵌合抗原受体T细胞对表达相应抗原的肿瘤细胞具有高效的杀伤作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高转染率的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，可以慢病毒包装系统为基础，达到60%以上的转染效率。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是，一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：（1）在缓冲液中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀，室温静置得到DNA/PEI复合物；（2）将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基，置于培养箱中，培养40～60小时；然后将步骤（1）的DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；然后再将培养皿置于培养箱中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续置于培养箱中；培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；（3）将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；得到含有慢病毒的重悬溶液；（4）将T细胞加入培养容器中，然后加入细胞因子与抗体复合物，培养40～60小时；然后加入步骤（3）的含有慢病毒的重悬溶液；然后加入终浓度为4～8μg/mL的聚凝胺，混匀后，密封培养容器；然后进行首次离心处理；离心结束后，去除密封；然后将培养容器置于培养箱中；培养18～32小时后，进行再次离心处理；然后去除离心上清；然后加入培养基得到混合物；然后将混合物加入新的培养容器中，培养得到嵌合抗原受体T细胞。上述技术方案中，步骤（1）中，嵌合抗原受体慢病毒表达载体为现有技术，以靶向肿瘤相关抗原分子的抗体序列可变区为基础，设计嵌合抗原受体，该受体包括信号肽、单链抗体序列、跨膜区及胞内共刺激信号区，采用全基因合成的方式合成该嵌合抗原受体序列，并使用EcoRI-BamHI酶切位点，将该嵌合抗原受体片段亚克隆至Lenti-puro慢病毒表达载体中，制备Lenti-puro-靶向肿瘤抗原-CAR慢病毒表达载体，即嵌合抗原受体慢病毒表达载体；缓冲液可以为PBS或者HBSS缓冲液。嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量比为10∶2∶1；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量总和与聚醚酰亚胺的质量比为3∶1。有利于提高载体对T细胞的转染效率。优选的技术方案中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合为分别将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合得到三份混合物；然后将三份混合物混合；可有利于各个质粒与聚醚酰亚胺形成DNA/脂质体复合物，提高对病毒包装工具细胞293细胞的转染效率。上述技术方案中，步骤（2）中，293细胞的接种密度为5000～7000个/cm2；完全培养基包括DMEM高糖、10%FBS；条件培养基包括DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）；其中，条件培养通过降低FBS的含量，可以避免在病毒生产过程中，293细胞增殖速度过快，细胞汇合度过高引起的细胞漂浮；通过培养基中添加HEPES，可以避免病毒制备过程中培养基pH值太低，引起病毒感染力下降；通过提添加丙酮酸钠，可以为细胞提供可利用的备用碳源。上述技术方案中，步骤（2）中，离心处理时的离心力为1100～1300xg，时间为8～12分钟；步骤（3）中，离心处理时的离心力为19000～22000xg，时间为1.5～2.5小时。上述技术方案中，步骤（3）中，通过添加蔗糖溶液作为缓冲垫，可以将慢病毒离心浓缩过程中非病毒的细胞碎片、杂蛋白等杂质阻滞于蔗糖缓冲垫中。蔗糖溶液与含有慢病毒的培养基上清的体积比为1∶6，蔗糖溶液的质量浓度为15%～30%。上述技术方案中，步骤（3）中，沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清，可以避免病毒上清对蔗糖缓冲垫的干扰，防止病毒上清与蔗糖缓冲垫混溶。优选的技术方案中，步骤（3）中，加入缓冲液后于0～5℃静置18～32小时；然后吹打均匀，得到含有慢病毒的重悬溶液；超速离心结束后，病毒沉淀贴合在离心管底部比较牢固，若立即加入缓冲液吹打，容易起泡，且高强度的机械吹打，会损伤慢病毒的感染力；低温静置过夜后，即可防止温度过高造成病毒的不稳定，亦可使病毒沉淀逐步松散，过夜后可轻松将沉淀重悬。上述技术方案中，步骤（4）中，细胞因子包括白介素2、白介素7、白介素15、白介素21，抗体复合物包括Anti-CD3-OKT3、Anti-CD28；通过使用Anti-CD3-OKT3、Anti-CD28对T细胞激活处理，可以避免体外培养T细胞的无效能；通过综合添加细胞因子复合物，可以提高体外T细胞中的中心记忆T细胞的比例，为基于T细胞的免疫细胞治疗带来益处。上述技术方案中，步骤（4）中，培养容器为方瓶，细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在缓冲液中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀，室温静置得到DNA/PEI复合物；（2）将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基，置于培养箱中，培养40～60小时；然后将步骤（1）的DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；然后再将培养皿置于培养箱中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续置于培养箱中；培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；（3）将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；得到含有慢病毒的重悬溶液；（4）将T细胞加入培养容器中，然后加入细胞因子与抗体复合物，培养40～60小时；然后加入步骤（3）的含有慢病毒的重悬溶液；然后加入终浓度为4～8μg/mL的聚凝胺，混匀后，密封培养容器；然后进行首次离心处理；离心结束后，去除密封；然后将培养容器置于培养箱中；培养18～32小时后，进行再次离心处理；然后去除离心上清；然后加入培养基得到混合物；然后将混合物加入新的培养容器中，培养得到嵌合抗原受体T细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在缓冲液中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀，室温静置得到DNA/PEI复合物；（2）将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基，置于培养箱中，培养40～60小时；然后将步骤（1）的DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；然后再将培养皿置于培养箱中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续置于培养箱中；培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；（3）将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；得到含有慢病毒的重悬溶液；（4）将T细胞加入培养容器中，然后加入细胞因子与抗体复合物，培养40～60小时；然后加入步骤（3）的含有慢病毒的重悬溶液；然后加入终浓度为4～8μg/mL的聚凝胺，混匀后，密封培养容器；然后进行首次离心处理；离心结束后，去除密封；然后将培养容器置于培养箱中；培养18～32小时后，进行再次离心处理；然后去除离心上清；然后加入培养基得到混合物；然后将混合物加入新的培养容器中，培养得到嵌合抗原受体T细胞。2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，缓冲液为PBS或者HBSS缓冲液；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量比为10∶2∶1；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量总和与聚醚酰亚胺的质量比为3∶1。3.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVS...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳庆，许波，李凡池，季平，
申请(专利权)人：爱康得生物医学技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32