一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法技术

本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。所述方法为采用外源自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。整个过程简单，快速，稳定，高效。为研究这些质粒的功能奠定基础。

Method for eliminating multi copy plasmid in Salmonella by using suicide vector

The invention belongs to the field of microorganisms, in particular to a method for eliminating multi copy plasmids in Salmonella by using suicide vectors and uses thereof. The method uses the exogenous suicide vector to eliminate the multi copy plasmids in the salmonella. The whole process is simple, fast, stable and efficient. To lay the foundation for studying the function of these plasmids.

【技术实现步骤摘要】
一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。
技术介绍
沙门菌是重要的人兽共患病原菌，也是世界范围内重要的食源性病原菌之一，具有重要的公共卫生意义。同时，沙门菌是畜禽的重要病原菌，对畜禽养殖业的危害性极大，目前需要建立新的有效防治措施。因此研究其致病机理对有效防治沙门菌感染具有重要的意义。质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质，常存在于细胞质内，为双螺旋、闭环DNA分子，可自身复制并能进行世代传递。它们在沙门菌的耐药、产毒素能力等方面起着极为重要的作用。有学者已经在鸡白痢沙门菌中发现一个4080bp的多拷贝小质粒，命名为pSPI12，质粒图谱见图5。(Li,Q.,etal.(2014)."Ageneknock-inmethodusedtopurifyplasmidpSPI12fromSalmonellaentericaserovarPullorumandcharacterizationofIpaJ."JMicrobiolMethods98:128-133.)。自杀载体(suicidevector)的特点是只能在特定的宿主菌中进行复制和存活，而在其它细菌中却不能长期存活。因此，自杀载体也是构建细菌基因缺失株和突变株的常用工具之一。pDM4是一种用于构建革兰氏阴性菌基因突变株的自杀载体，由pGF704质粒衍生而来(Miltonetal.1996)，当革兰氏阴性菌的生存环境中含有蔗糖时，蔗糖可以诱导pDM4自杀载体上sacB基因的表达，产生蔗糖果聚酶，催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并将果糖聚合成高分子量的果聚糖。果聚糖积累革兰氏阴性菌产生毒性作用，造成细胞死亡，从而杀死细菌。而只有失去了含该基因的质粒，宿主菌才能存活下来。自杀载体图谱见图6。目前的质粒消除方法主要采用化学消除剂(嵌合染料、香豆霉素、新生霉素、利福平、丝裂霉素C、十二烷基硫酸钠)和物理学消除法(高温、高压电穿孔、原生质体)，以及分子生物学消除法(转座子、质粒不相容性)达到对质粒的消除，但是这些方法仅对某些菌株中的部分质粒有效，即在不同的菌株之间，或在不同的质粒之间，这些质粒消除方法的有效性存在着极大的差异。此外许多消除剂本身也是诱变剂，容易引起宿主菌基因的突变。所以研制定向消除某一定特质粒或者某一多拷贝质粒的分子生物学技术显得尤为重要。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，为采用外源自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌S06004。优选地，所述多拷贝质粒为pSPI12。pSPI12的大小为4080bp。pSPI12的质粒图谱如图5所示。所述多拷贝质粒pSPI12的详细信息还可参考Li,Q.,etal.(2014)."Ageneknock-inmethodusedtopurifyplasmidpSPI12fromSalmonellaentericaserovarPullorumandcharacterizationofIpaJ."JMicrobiolMethods98:128-133。优选地，所述自杀载体为pDM4。自杀载体pDM4的图谱如图6所示。进一步地，所述方法，包括如下步骤：(1)构建重组自杀载体：将待消除的目标片段连接至自杀载体上，获得重组自杀载体；(2)构建供体菌：将步骤(1)所得重组自杀载体导入感受态细菌中，获得供体菌；(3)接合转移：将步骤(2)所得供体菌与受体沙门菌混合培养，筛选获得发生同源重组的沙门菌菌株；(4)蔗糖筛选：将步骤(3)筛选获得的同源重组的沙门菌菌株接种于含蔗糖的培养基中，筛选出可存活且多拷贝质粒被消除的菌株。优选地，所述步骤(1)中，所述目标片段的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。优选地，所述自杀载体为pDM4。自杀载体pDM4的图谱如图6所示。进一步地，所述自杀载体为XbaI单酶切的pDM4。所述pDM4含有氯霉素抗性标记。优选地，所述步骤(2)中，所述感受态细菌为二氨基庚二酸(DAP)依赖性感受态细菌。优选地，所述步骤(2)中，所述感受态细菌为E.coliχ7213感受态细菌。进一步地，所述步骤(3)中，通过结合转移的方式使重组自杀载体进入受体沙门菌中。优选地，所述步骤(3)中，使用无二氨基庚二酸(DAP)且含氯霉素抗性的LB平板筛选出目标菌株。优选地，，所述步骤(3)中，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌S06004。进一步地，所述步骤(4)中，利用蔗糖诱导自杀载体启动死亡。优选地，所述步骤(4)中，所述培养基无氯化钠。进一步地，所述培养基为LB培养基。优选地，所述步骤(4)中，所述培养基中，蔗糖的质量体积浓度为5～20％。进一步地，所述培养基中，蔗糖的质量体积浓度为10％。优选地，所述步骤(4)中，采用PCR方法筛选出多拷贝质粒被消除的菌株。本专利技术的第二方面，提供前述方法用于构建多拷贝质粒消除沙门菌株的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术建立的利用外源自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，既可消除特定单拷贝质粒，也可消除多拷贝质粒，整个过程简单，快速，稳定，高效。为研究这些质粒的功能奠定基础。附图说明图1：重组质粒X7213(pDM4-ΔpSPI12)的PCR鉴定，M:DNA分子质量标准；1～2:ipaJupF/R扩增ipaJ上游片段；3:SalIup和SacIdown扩增pDM4-ΔpSPI12质粒的产物；图2：S06004-ΔpSPI12内测引物的PCR鉴定，M:DNA分子质量标准；1～6:ipaJNBF/R扩增S06004-ΔpSPI12的产物；7:ipaJNBF/R扩增S06004的产物。图3：S06004-ΔpSPI12外测引物的PCR鉴定，M:DNA分子质量标准；1～3:ipaJOutF/R扩增S06004-ΔpSPI12的产物；4:ipaJOutF/R扩增S06004的产物。图4：pSPI12/KmR导入缺失株S06004-ΔpSPI12的PCR鉴定，M:DNA分子质量标准；1:ipaJNBF/R扩增S06004-ΔpSPI12-pSPI12/KmR的产物；2:ipaJNBF/R扩增S06004-ΔpSPI12的产物。图5：pSPI12的质粒图谱。图6：自杀载体pDM4的图谱。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，为采用自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。

【技术特征摘要】
1.一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，为采用自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多拷贝质粒为pSPI12。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自杀载体为pDM4。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，包括如下步骤：(1)构建重组自杀载体：将待消除的目标片段连接至自杀载体上，获得重组自杀载体；(2)构建供体菌：将步骤(1)所得重组自杀载体导入感受态细菌中，获得供体菌；(3)接合转移：将步骤(2)所得供体菌与受体沙门菌混合培养，筛选获得发生同源重组的沙门菌菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，李求春，尹超，徐黎娟，尹克全，胡亚辰，孙林，李扬，陈祥，潘志明，耿士忠，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32