一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针制造技术

本发明专利技术公开了一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针，其化学结构式如式（1）所示。本发明专利技术的探针廉价易得，使用方便，可以特异性与过氧化氢发生反应，生成荧光发射能力更强的罗丹明衍生物，在检测过氧化氢过程中不会受到其他相关氧化物的干扰，对过氧化氢具有良好的选择性，能对活细胞和活动物中的过氧化氢进行准确检测。

Hydrogen peroxide enhanced fluorescent probe based on Luo Danming derivative

The present invention discloses a hydrogen peroxide enhanced fluorescent probe based on a Luo Danming derivative, whose chemical structure is shown in formula (1). The probe of the invention is cheap and easy to use, can specifically react with hydrogen peroxide, Luo Danming derivatives generated stronger fluorescence emission, interference of other related oxides are not in the detection of hydrogen peroxide in the process, has good selective to hydrogen peroxide, to living cells and activities in the accurate detection of hydrogen peroxide.

【技术实现步骤摘要】
一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针
本专利技术涉及一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢荧光探针，属于分析化学

技术介绍
活性氧（ROS）在生物体内普遍存在，是含氧自由基和含氧非自由基的总称，在许多生理和病理过程中起着重要的作用。活性氧通常由生物体内的氧化应激、炎症等生理和病理过程的酶促和非酶促反应产生。过氧化氢（H2O2），作为一种重要的活性氧，是一种重要的信号分子，广泛参与生物体系内各种各样的信号传导过程，同时也是氧化应激等相关疾病的标记物。生物体内的过氧化氢的产生与细胞因子、生长因子和神经递质等激活白细胞氧化酶相关。适量水平下，生物体内的过氧化氢对生物正常的生理过程有益，可参与细胞内蛋白质的可逆氧化，以及调剂蛋白质的磷酸化到基因表达等众多细胞过程。但是，生物体内过氧化氢浓度的异常与人类的许多疾病密切相关，包括癌症、心血管疾病、阿兹海默症等。因此，检测生物体内的过氧化氢水平对于调查研究相关疾病的发生、发展具有重要的作用。传统的过氧化氢检测方法包括滴定法、化学发光法、电化学法（极谱法、电流滴定法、恒电位法）、比色法等。但是，这些方法通常会破坏测样品，耗费高，不适用于生物体内过氧化氢的实时检测。相比之下，荧光成像具有不破坏样品、高灵敏度、高选择性和实时监测等特点，可为检测生物体内的过氧化氢提供了一种可行的方法。目前，已开发的过氧化氢荧光探针大都侧重于蓝色或绿色荧光团，但是这种方法使用的激发波长较短，不适合小动物活体成像，因此具有一定的局限性。相比之下，红色荧光探针依靠具有波长较长的红色荧光的提供提供信号，可适用于活体成像。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测过氧化氢的红色荧光探针。本专利技术所述的检测过氧化氢的荧光探针，为罗丹明衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构式如式（1）所示：（1）上述检测过氧化氢的比率型荧光探针以如下方法制备：。（1）中间体2制备：将中间1（1mmol）、N,N-双(三氟甲磺酰基)苯胺（1mmol）和N,N-二异丙基乙胺（2mmol）溶于5mlDMF中，室温下反应6小时，加入5ml水，使用5ml乙酸乙酯萃取，将油相真空干燥得粗产品。使用柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:5）对粗产品进行纯化，得纯品中间体2（产率73%）。（2）荧光探针（化合物3）的制备：将中间体2（1mmol）、双联频哪醇硼酸酯（1mmol）、1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯二氯甲烷络合物（0.2mmol）和醋酸钾（1.5mmol）溶于10ml甲苯中，氮气保护下回流6h。反应结束之后，真空除溶剂，得粗产品。使用柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:4）对粗产品进行纯化，得探针纯品（产率69%）。本专利技术所述的基于罗丹明衍生物的过氧化氢荧光探针在检测活细胞中过氧化氢中的应用。本专利技术所述荧光探针可以应用于活细胞内的过氧化氢含量的定量分析。该探针作为过氧化氢的特异性探针，能和探针发生氧化反应，进而生成荧光更强的罗丹明衍生物。通过定量检测溶液所发射的荧光的强度，可以确定细胞中的过氧化氢的含量。具体测定方法为：25℃条件下，在荧光探针的PBS（含有5%甲醇，pH=7.4，20mM）溶液中，将过氧化氢的PBS溶液加入到探针体系中，测定溶液的荧光强度，根据荧光作为过氧化氢含量的评价指标。具体的，本专利技术所述荧光探针在检测活细胞和活动物中过氧化氢的应用实例：（1）将HeLa细胞加入铺有盖玻片的培养皿中，并置于二氧化碳培养箱中培养，36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿冲洗，加入5μM本专利技术所述的过氧化氢荧光探针后37℃下培养40分钟。之后，使用PBS冲洗，制片，在激光共聚焦显微镜下观察细胞，进行荧光成像。并列的，向铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿中加入50μM浓度的过氧化氢，37℃下培养1小时，制片，在共聚焦显微镜下观察细胞，进行荧光成像。（2）首先向小鼠腹腔内注射甲苯噻嗪（10mg.kg-1）和氯胺酮（80mg.kg-1），然后注射本专利技术所述的过氧化氢荧光探针（50nmol），随后进行小鼠成像实验。在此小鼠基础上，向小鼠腹腔注射100μM过氧化氢，20min之后进行小鼠成像实验。本专利技术提供了一类用于特异性识别过氧化氢的探针，其与过氧化氢反应之后可生成具有荧光发射能力更强的罗丹明衍生物，并依靠长波长的荧光发射峰的强度为信号，可以用于小鼠成像。该探针可发射长波长荧光，能够广泛用于检测活细胞和小鼠中的过氧化氢。本专利技术的有益效果是：所制备的罗丹明衍生物的荧光探针能够与过氧化氢进行特异性反应，通过荧光信号的产生对过氧化氢进行定性检测，能够对活细胞中的过氧化氢进行定量检测。此外该荧光探针廉价易得，可经化学合成获得，且合成工艺简单易行。进一步的，本专利技术提供的用于检测过氧化氢的荧光探针易于制备、使用方便，能够快速检测活细胞和活动物中的过氧化氢。附图说明图1是荧光探针的核磁氢谱图谱。图2是荧光探针的液质数据（LC-MS）图谱。图3是荧光探针对不同物质的选择性图谱。其中，相关分析物为：次氯酸钠、一氧化氮、半胱氨酸、羟基自由基、过氧化二叔丁基、过氧化二叔丁醇、谷胱甘肽、维生素C和硝酸钠。图4是荧光探针与过氧化氢的线性关系数据。图5是本专利技术所述的荧光探针对细胞内过氧化氢监测的照片。其中：A、B和C依次为探针（10μM）在细胞中明场照片、红色通道照片、明场和红色通道叠加照片；D、E和F依次为探针（10μM）和过氧化氢（200μM）在细胞中明场照片、红色通道照片、明场和红色通道叠加照片。图6是本专利技术所述的荧光探针对小鼠内过氧化氢监测的照片。其中，A为注射探针的小鼠成像照片；B为注射探针和过氧化氢的小鼠成像照片。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。实施例1荧光探针的制备：将中间1（1mmol）、N,N-双(三氟甲磺酰基)苯胺（1mmol）和N,N-二异丙基乙胺（2mmol）溶于5mlDMF中，室温下反应6小时，加入5ml水，使用5ml乙酸乙酯萃取，将油相真空干燥得粗产品。使用柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:5）对粗产品进行纯化，得纯品中间体2（产率73%）。将中间体2（1mmol）、双联频哪醇硼酸酯（1mmol）、1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯二氯甲烷络合物（0.2mmol）和醋酸钾（1.5mmol）溶于10ml甲苯中，氮气保护下回流6h。反应结束之后，真空除溶剂，得粗产品。使用柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:4）对粗产品进行纯化，得探针纯品（产率69%）。荧光探针的核磁氢谱和液质数据见图1和图2。实施例2荧光探针对不同物质的选择性鉴定预先准备10份5mL的5μM荧光探针PBS溶液(含5%甲醇)，然后分别向所述10份体系中依次加入50μL浓度为100μM的过氧化氢、次氯酸钠、一氧化氮、半胱氨酸、羟基自由基、过氧化二叔丁基、过氧化二叔丁醇、谷胱甘肽、维生素C和硝酸钠的PBS溶液。进行荧光检测（λEx=580nm）；计算各体系中638nm处的荧光强度I638，结果见图3。其中显示，所述荧光探针对过氧化氢有较好的选择性。实施例3荧光探针与过氧化氢的线性关系配制1mL浓度为梯度的过氧化氢的PBS溶液体系，然后均分别加入9mL浓度为50μM的探针PBS溶液(含5%甲醇)，进行荧光检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的化学结构式如式（1）所示：

【技术特征摘要】
1.一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的化学结构式如式（1）所示：（1）。2.根据权利要求1所述的基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针，其特征在于：由以下方法制备而成：（1）中间体2制备：将1mmol中间体1、1mmolN,N-双(三氟甲磺酰基)苯胺和2mmolN,N-二异丙基乙胺溶于5mlDMF中，室温下反应6小时，加入5ml水，使用5ml乙酸乙酯萃取，将油相真空干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，董宝利，宋学真，孔秀琪，王超，张楠，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37